基于信息熵理论正交试验优选荆防小儿口服液提取工艺

2018-12-20唐林彭颖雷昌乔勇朱坤夏新华

中国中医药信息杂志 2018年10期

唐林彭颖雷昌乔勇朱坤夏新华

摘要：目的优选荆防小儿口服液的最佳提取工艺。方法以苦杏仁苷转移率、升麻素苷转移率、5-O-甲基维斯阿米醇苷转移率、浸膏得率为评价指标，采用正交试验设计及信息熵理论考察加水量、提取时间对提取工艺的影响。结果荆防小儿口服液的最佳提取工艺条件为：加水量为10倍量，提取时间为1.0 h，回流提取2次。结论本研究优选出的提取工艺简单、稳定，可为荆防小儿口服液的工业化生产提供依据。

关键词：荆防小儿口服液;正交试验;提取工艺;信息熵

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.020

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）10-0091-05

Optimization of Extraction Process of Jingfang Children Oral Liquid with Orthogonal TestBased on Information Entropy Theory

TANG Lin¹， PENG Ying²， LEI Chang²， QIAO Yong²， ZHU Kun²， XIA Xin-hua²

1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China; 2. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective To optimize the extraction process of Jingfang Children Oral Liquid. Methods Orthogonal test design and information entropy theory were used to study the influence of water volume and extraction time on extraction process with transferring rates of amygdalin， prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-methylvisammioside， and extract yield as evaluation indexes. Results The optimal extraction process conditions were as follows： the ratio of water volume to raw materials weight was 10：1， extraction time was 1.0 h and extracted twice under reflux. Conclusion The optimal extraction process is simple and stable， which can provide references for industrial production of Jingfang Children Oral Liquid.

Keywords： Jingfang Children Oral Liquid; orthogonal test; extraction process; information entropy

荆防小儿口服液由荆芥、防风、苦杏仁、生石膏等12味中药组方制备而成，具有清热解表、止咳化痰的功效，为湖南中医药大学第一附属医院张涤教授经验方，临床用于治疗小儿急性支气管炎和小儿慢性支气管炎的急性发作。防风为方中君药，色原酮类化合物升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷是其指標成分，具有明显的解热、抗炎、镇痛作用^[1]。苦杏仁为方中臣药，能降肺气之上逆，可宣肺气之郁滞，为止咳平喘之要药，现代研究表明，其指标成分苦杏仁苷具有抗炎、抗溃疡、抗肺纤维化等药理活性^[2]，可起到镇咳平喘作用^[3]。由于升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷等成分均易溶于水^[4]，同时考虑到水煎的传统提取方法，确定了本制剂的水提工艺。为进一步确定该制剂合理的生产工艺，保证其临床疗效，本试验以升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和苦杏仁苷的提取转移率及浸膏得率为指标综合评分，采用正交试验法及信息熵理论对提取工艺进行优选，筛选该方的最佳提取工艺参数，为该制剂的中试放大及产业化生产提供数据支持。

1 仪器与试药

1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司;Hei-Vap Advantage（ML）型旋转蒸发仪，德国Heidolph;AL-204型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;SK-7200HP超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司;SXKW数显控温电热套，北京市永光明医疗仪器厂;Purelab Option Q15超纯水机（法国威立雅ELGA）。

饮片均购自康美药业股份有限公司，符合2015年版《中华人民共和国药典》各药项下规定。对照品苦杏仁苷（批号110820-201506，纯度93.4%）、升麻素苷（批号111522-201511，纯度94.8%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号111523-201509，纯度95.8%）均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 浸膏得率测定

精密量取水提样品药液25 mL（V₁），置已干燥至恒重的蒸发皿（M₁）中，水浴蒸干，于105 ℃干燥5 h，取出，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密称定质量（M₂），计算样品的浸膏得率。浸膏得率=（M₂-M₁）V₂/m_总V₁。式中，m_总为水提药液中药材总质量，V₂为水提药液总体积。

2.2 指标成分测定

2.2.1 苦杏仁苷含量测定

2.2.1.1 色谱条件

采用Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（20∶80），检测波长210 nm，进样量10 μL，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，记录时间25 min。

2.2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取苦杏仁苷对照品9.8 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得浓度为183.06 μg/mL的苦杏仁苷对照品溶液，于冰箱中冷藏备用。

2.2.1.3 供试品溶液的制备

精密量取水提样品药液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，备用。

2.2.1.4 阴性对照溶液的制备

按处方比例称取除苦杏仁外的其余饮片，加水提取2次，浓缩定容。精密量取浓缩液2 mL，按上述供试品溶液制备方法制备，即得。

2.2.2 升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量测定

2.2.2.1 色谱条件

采用Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～15 min，12%A;15～40 min，12%～28%A），检测波长254 nm，进样量10 μL，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，记录时间40 min。

2.2.2.2 对照品贮备液的制备

分别精密称取升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品14.5、15.4 mg，分别置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，于冰箱中冷藏备用。

2.2.2.3 混合对照品溶液的制备

分别精密量取升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品贮备液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为27.49、29.51 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2.4 供试品溶液的制备

精密量取水提药液2 mL置离心管中，加入8 mL甲醇，充分摇匀，离心后取上清液于旋转蒸发仪上浓缩至干（60 ℃），残渣加甲醇使溶解，加至中性氧化铝柱（100?200目，4 g，内径1 cm）上，用50%乙醇20 mL洗脱，收集洗脱液，于旋转蒸发仪上浓缩至干（60 ℃），残渣用甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，备用。

2.2.2.5 阴性对照溶液的制备

按处方比例称取除防风外的其余饮片，加水提取2次，浓缩定容。精密量取浓缩液2 mL，按上述供试品溶液制备方法制备，即得。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 专属性试验

分别精密吸取“2.2.1”项下苦杏仁苷对照品溶液、供试品溶液、苦杏仁阴性对照溶液，及“2.2.2”项下升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品溶液、供试品溶液、防风阴性对照溶液，各10 μL，按上述相应的色谱条件进样检测，记录色谱图。结果表明供试品色谱中苦杏仁苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷与其他成分均分离良好（R>1.5），且阴性对照无干扰。

2.2.3.2 线性关系考察

分别精密量取苦杏仁苷对照品溶液（282.07 μg/mL）及升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品溶液（各取对照品贮备液5 mL，加甲醇定容至25 mL）1、2、4、6、8、10 μL，按上述相应的色谱条件进样，测定峰面积积分值。以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程，结果见表1。

2.2.3.3 精密度试验

分别精密量取苦杏仁苷对照品溶液及升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液各10 μL、按上述色谱条件连续进样6次，测量记录其峰面积，结果苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的RSD分别为2.07%、2.02%、0.95%，表明仪器精密性良好。

2.2.3.4 稳定性试验

分别取同一供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h注入液相色谱仪，按上述色谱条件进样检测，记录峰面积积分值，结果苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的RSD分别为1.16%、1.73%、1.69%，表明供试品溶液在24 h内稳定性。

2.2.3.5 重复性试验

精密量取水提药液2 mL，共12份，等分为2组，分别按“2.2.1.3”与“2.2.2.4”项下方法各制备6份供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定并计算。结果样品中苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷RSD分别为2.73%、2.84%、2.80%，表明本法重复性好。

2.2.3.6 加样回收率试验

精密量取水提药液1 mL，共6份，分别精密加入苦杏仁苷对照品溶液（612.70 μg/mL）1 mL;另精密量取水提药液1 mL，共6份，分别精密加入升麻素苷对照品溶液（40.57 μg/mL）2 mL与5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液（41.39 μg/mL）1 mL。分别按上述色谱条件测定苦杏仁苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，计算得苦杏仁苷的平均回收率与RSD分别为99.20%、2.65%，升麻素苷的平均回收率与RSD分别为100.74%、2.61%，5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均回收率与RSD分别为99.77%、1.98%，表明本法测定的准确度高。

2.3 正交试验优选水提工艺

本制剂处方由12味中药组成，经处方分析，确定对方中防风等3味药先采用蒸馏法提取挥发油^[5-6]，其药渣再与苦杏仁等9味混合用水煎提。前期已对挥发油提取工艺进行优化，本试验基于相关文献^[7]及预试验结果，选取加水量（A）、提取时间（B）为考察因素，采用正交设计对水提工艺进行研究。

2.3.1 正交试验设计

按处方比例称取饮片216 g，共9份，先采用蒸馏法提取防风等3味药的挥发油，其药渣与苦杏仁等9味混合（其中苦杏仁于水沸后加入），用L₉（3⁴）正交表安排试验，加水回流提取2次，收集2次提取液并与提油后的药渣滤液合并，浓缩定容至500 mL。分别按上述色谱条件测定并计算苦杏仁苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的提取转移率及浸膏得率。

2.3.2 水提工艺数据处理及分析

采用熵权法及专家咨询法对评价指标进行权重系数分配，计算综合评分。提取工艺评价指标多分为浸膏得率与有效成分转移率两类，其中有效成分转移率为主要评价指标，而浸膏得率常作为参考指标，本試验对有效成分转移率与浸膏得率分别评定权重系数。采用专家建议将浸膏得率的权重系数定为0.1，有效成分转移率的总权重系数定为0.9。

根据文献方法^[7-8]将有效成分建立原始评价指标矩阵（X），将原始矩阵转换为概率矩阵（P），计算各项指标（苦杏仁苷转移率、升麻素苷转移率和5-O-甲基维斯阿米醇苷转移率）的信息熵（H_i），计算第i项指标的系数（W_i）。

有效成分转移率总权重系数为0.9，则修正后第i项指标的系数（W_i*）=W_i×0.9=[0.738 8 0.107 8 0.053 4]。

对于1个m行n列的概率矩阵，综合评价指标M_m=P_1mW₁+P_2mW₂+P_3mW₃+…+P_nmW_n，即苦杏仁苷转移率、升麻素苷转移率、5-O-甲基维斯阿米醇苷转移率及浸膏得率的权重系数依次为0.74、0.11、0.05、0.10。

对概率矩阵数据进行加权处理，得到综合评分。综合评分=苦杏仁苷转移率÷苦杏仁苷转移率_max×0.74+升麻素苷转移率÷升麻素苷转移率_max×0.11+5-O-甲基维斯阿米醇苷转移率÷5-O-甲基维斯阿米醇苷转移率_max×0.05+浸膏得率÷浸膏得率_max×0.1。

正交试验结果见表2，方差分析见表3。

由直观分析可以看出，A因素各水平的K值依次为K3>K2>K1、B因素各水平的K值依次为K3≈K2>K1，对总的提取效果的影响为B>A;方差分析显示，A、B两因素的影响均有显著性。综合上述分析，从缩短生产时间和减少能耗等角度考虑，由于B₂与B₃的K值差别很小，可选B₂。因此，确定最优提取工艺方案为A₃B₂，即加10倍量水，提取1.0 h。

2.3.3 验证试验

参照“2.3.1”项下提取工艺，按上述优选的最佳工艺方案A₃B₂，平行试验3次，结果见表4。该方案与正交试验表中相同试验方案（即综合评分最高的8号试验）结果相近，苦杏仁苷转移率、升麻素苷转移率、5-O-甲基维斯阿米醇苷转移率、浸膏得率RSD分别为1.00%、1.05%、0.92%、2.77%，说明该工艺条件合理可行，结果稳定可靠。

2.3.4 提取次数考察

在上述正交验证试验水提2次完成后，向药渣中加入10倍量水，提取1.0 h，浓缩定容至500 mL，即得第3次提取液。按上述方法分别测定苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的提取转移率及浸膏得率。结果表明，第3次提取液中苦杏仁苷转移率、浸膏得率分别为6.28%、2.22%，升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷的转移率几乎为0。4个指标所占3次提取率的比率均小于10%，故从降低生产成本角度考虑，以提取2次为宜。

3 讨论

本试验曾考虑将升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和苦杏仁苷用同一HPLC条件进行检测，但发现苦杏仁苷与升麻素苷的色谱峰存在阴性干扰，故参照药典及文献方法^[9-11]在2种不同的HPLC条件下分别对上述3种成分进行测定。测定苦杏仁苷时，发现流速与柱温对其分离影响不大，而采用适宜的色谱柱并调节流动相的比例可显著改善苦杏仁苷的分离效果，且阴性对照无干扰。测定升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷时，采用中性氧化铝柱对水提药液进行纯化，可消除杂质对测定的干扰。

本试验前期曾对苦杏仁进行了冷水加热提取与沸水直接提取的比较。结果表明，苦杏仁于水沸后加入能显著增加苦杏仁苷的转移率^[12]，可能是“杀酶保苷”的效果。

采用正交设计优选中药制剂提取工艺时，常涉及“提取次数”的问题。文献报道常将其作为“正交试验”的考察因素，笔者认为这样不妥。因为正交设计要求各因素之间必须独立，否则将影响其他因素的分析结果^[13]。而提取次数为非独立变量，其变化同时伴随总的提取溶剂用量与提取时间的变化，其改变对提取效果的影响主要由总的提取溶剂用量与提取时间发生较大改变所致，因而对正交试验结果进行方差分析，“提取次数”通常表现为具有显著影响，其他因素的影响则不显著^[14-15]，故将“提取次数”纳入正交试验设计进行考察，会掩盖其他提取工艺因素的显著性分析结果，进而影响提取工艺优化结果的可靠性。因此，正交试验设计时应避免将“提取次数”纳入考察因素的选择。

本试验选择方中多个活性成分的转移率和浸膏得率作为提取工艺的评价指标，符合中药复方多成分多靶点起效的特点。各指标间的客观赋权一直困扰着中药提取工艺的综合评价。传统的评价方法多采用专家咨询法，具有一定的主观性^[16]，信息熵理论基于对试验数据的充分分析，减少了主观因素对试验结果的干扰^[17]，但往往忽略了中藥提取工艺的实际情况，如浸膏得率常作为中药提取工艺的评价指标，但一般不作为主要评价指标，故本试验将专家咨询法与信息熵理论相结合应用于多指标的综合分析，提升了本试验研究的严谨性及合理性。另外，将提取次数置于验证试验中进行考察，可避免其对正交试验结果的干扰，既保证了提取工艺考察数据的科学性，又可保证其完整性。优化后的提取工艺结果稳定可靠，可为该处方的工业化生产及进一步开发提供重要依据，同时也可为今后中药提取工艺正交试验设计的因素选择提供参考。

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