王迎春 王晓亚 麻景梅 牛丽颖

摘要：目的  建立夏枯草飲片标准汤剂质量评价方法，并对夏枯草饮片及其标准汤剂进行相关性研究。方法  采用HPLC测定15批夏枯草饮片及标准汤剂中咖啡酸和迷迭香酸的含量，计算转移率、出膏率;采用超高液相色谱法建立夏枯草饮片及其标准汤剂指纹图谱，并进行相关性分析。结果  15批夏枯草饮片中咖啡酸和迷迭香酸的含量分别为0.11～0.26 mg/g和2.35～7.57 mg/g，标准汤剂中咖啡酸和迷迭香酸的含量分别为3.32～4.11 mg/g和8.34～32.83 mg/g。咖啡酸转移率为151.6%～260.6%，平均（193.6±58.1）%;迷迭香酸转移率为28.3%～58.1%，平均（47.0±14.1）%;出膏率为9.1%～12.9%，平均（10.8±3.2）%。夏枯草饮片及标准汤剂指纹图谱分别有7个共有峰，对比两者对照指纹图谱，共6个共有峰。结论  15批夏枯草饮片与标准汤剂的化学成分基本一致，建立的质量评价方法可用于标准汤剂及相关制剂的质量控制。

关键词：夏枯草;标准汤剂;饮片;指纹图谱;相关性

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.017

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2018）10-0079-05

Correlation Study on Quality Evaluation of Decoction Pieces and Standard Decoction of Prunellae Spica

WANG Ying-chun， WANG Xiao-ya， MA Jing-mei， NIU Li-ying

Hebei University of Chinese Medicine， Hebei TCM Formula Granule Engineering&Technology; Research Center， TCM Formula Granule Research Center of Hebei Province University， Shijiazhuang 050091， China

Abstract： Objective To establish the quality evaluation method for standard decoction of Prunellae Spica; To conduct the correlation study on decoction pieces and standard decoction of Prunellae Spica. Methods The contents of caffeic acid and rosemary acid of 15 batches of decoction pieces and standard decoction of Prunellae Spica were determined by HPLC， and the transfer rate and the extractum rate were calculated. The fingerprints of decoction pieces and standard decoction were evaluated by UPLC and the correlations among them were evaluated. Results The contents of caffeic acid and rosemary acid of 15 batches of decoction pieces were in the range of 0.11–0.26 mg/g and 2.35–7.57 mg/g. The contents of caffeic acid and rosemary acid of 15 batches of standard decoction were in the range of 3.32–4.11 mg/g and 8.34–32.83 mg/g. The transfer rate of caffeic acid was in the range of 151.6%–260.6%， and the average transfer rate was （193.6±58.1）%. The transfer rate of rosemary acid was in the range of 28.3%–58.1%， and the average transfer rate was （47.0±14.1）%. The extractum rate was in the range of 9.1%–12.9%， and the average extractum rate was （10.8±3.2）%. Seven common peaks were confirmed in the fingerprints of decoction pieces and standard decoction of Prunellae Spica. Compared the two reference fingerprints， there were six common peaks. Conclusion The main chemical constituents of decoction pieces and standard decoction of Prunellae Spica are basically identical. The established quality evaluation method can be used for quality control of standard decoction and related preparations.

Keywords：Prunellae Spica; standard decoction; decoction pieces; fingerprint; correlation

随着中药饮片形式的不断革新，配方颗粒、破壁饮片等多种现代中药剂型不断出现，弥补了传统中药饮片携带不便、煎煮耗时等缺陷。但由于各生产企业所用中药饮片来源及生产工艺各异，缺乏统一的质量标准和监管，市场上现代中药剂型普遍存在质量不均一、剂量不统一等问题^[1]。2016年，国家药典委員会发布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》，提出将标准汤剂作为中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物。中药饮片标准汤剂是以中医理论为指导、临床应用为基础的单味饮片水煎剂，可作为一种标准物质和标准体系，标化新型中药制剂，保证其质量稳定、均一，确保临床用药的准确性和剂量的一致性^[2]。

夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，味辛、苦，性寒，归肝、胆经，具有清肝泻火、明目、散结消肿的功效^[3]。现代研究表明，夏枯草具有降血压、降血糖、抗菌、抗氧化、抗病毒及免疫系统调节和呼吸系统调节等作用，临床应用较为广泛^[4-7]。本研究选用6个不同产地的15批夏枯草饮片制备标准汤剂，测定并分析夏枯草饮片与标准汤剂中有效成分的含量及其变化，计算转移率和出膏率;建立夏枯草饮片及标准汤剂的超高液相色谱指纹图谱，对二者的相关性进行研究，为夏枯草水煎液相关制剂的质量控制提供参考。

1  仪器与试药

高效液相色谱仪：LC-15C泵，SPD-15C型紫外检测器，SIL-10AF自动进样器，CTO-15C柱温箱，岛津LC色谱工作站（日本岛津）;超高效液相色谱仪：ACQUITY UPLC H-Class系统（PDA检测器），Empower3色谱工作站（美国沃特世公司）;TB-215D、BSA224S-CW电子分析天平（赛多利斯）;RE-3000型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）;FD-1C-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）。

15批夏枯草饮片，神威药业集团有限公司提供，产地分别为江苏、浙江、湖南、湖北、河南、安徽，经神威药业集团有限公司质检中心检测，符合2015年版《中华人民共和国药典》（一部）夏枯草项下有关规定;咖啡酸对照品（批号110885-200102）、迷迭香酸对照品（批号111871-201505），中国食品药品检定研究院;甲醇、乙腈为色谱纯、水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2  方法与结果

2.1  溶液的制备

2.1.1  夏枯草标准汤剂

取夏枯草饮片100 g，煎煮2次。一煎加水16倍，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸20 min;二煎加水12倍，武火沸腾，文火保持微沸15 min，趁热用100目筛网分离煎液。合并煎液，迅速冷却，60 ℃真空减压浓缩至200 mL左右，冷冻干燥，得干膏粉。

2.1.2  对照品溶液

精密称取咖啡酸、迷迭香酸对照品适量，加50%乙醇制成每l mL含10.05 ?g咖啡酸、52.55 ?g迷迭香酸的溶液，即得。

2.1.3  供试品溶液

2.1.3.1  标准汤剂供试品溶液

取干膏粉适量，研细，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）10 min，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.1.3.2  饮片供试品溶液

取15批饮片粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）10 min，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.2  咖啡酸和迷迭香酸含量测定

2.2.1  色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.1%磷酸为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱（0～5 min，75%～68%A;5～10 min，68%～65%A;10～15 min，65%～62%A;15～25 min，62%～60%A;25～35 min，60%A）;流速：1.0 mL/min;柱温：35 ℃;检测波长：330 nm;进样量：10 μL。

2.2.2  方法学考察

2.2.2.1  线性关系考察

精密吸取对照品溶液2、4、8、12、16、20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积。以咖啡酸的进样量为横坐标，测得的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明咖啡酸在0.020 1～0.201 0 μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=5.567 1×10⁶X+5.234 9×10³，r=0.999 8;以迷迭香酸的进样量为横坐标，测得的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明迷迭香酸在0.105 1～1.051 0 μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=1.807 1×10⁶X+1.173 1×10⁴，r=0.999 8。2.2.2.2  精密度试验

精密吸取对照品溶液10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，结果咖啡酸和迷迭香酸峰面积RSD分别为0.5%和0.43%，表明仪器精密度良好。

2.2.2.3  稳定性试验

精密称取同一批干膏粉约0.1 g，按“2.1.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、7、12、18、24 h进样10 μL进行测定，结果咖啡酸和迷迭香酸峰面积RSD分别为1.21%和1.09%，表明夏枯草供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.2.4  重复性试验

精密称取同一批干膏粉6份，每份约0.1 g，按“2.1.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样10 μL进行测定，结果咖啡酸和迷迭香酸含量RSD值分别为1.88%和1.26%，表明本方法重復性良好。

2.2.2.5  加样回收率试验

取同一批干膏粉6份，每份约0.05 g，精密称定。精密加入一定体积的咖啡酸、迷迭香酸对照品溶液，按“2.1.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，每份平行测定2次，结果咖啡酸、迷迭香酸的平均回收率分别为100.47%、101.86%，表明本方法可用于咖啡酸和迷迭香酸含量的准确测定，结果见表1。

2.2.3  样品含量测定

按“2.2.1”项下色谱条件，分别测定15批夏枯草饮片及标准汤剂供试品溶液中咖啡酸和迷迭香酸的含量。

2.3  标准汤剂出膏率及转移率测定

取“2.1.1”项下干膏粉，称定质量，计算标准汤剂的出膏率。出膏率（%）=干膏质量÷饮片质量×100%。结果15批标准汤剂的出膏率为9.1%～12.9%，平均（10.8±3.2）%。分别将饮片和标准汤剂中咖啡酸及迷迭香酸含量测定结果代入公式，计算转移率。转移率（%）=标准汤剂中指标成分含量÷饮片中指标成分含量×100%。结果咖啡酸的转移率为151.6%～260.6%，平均为（193.6±58.1）%;迷迭香酸的转移率为28.3%～58.1%，平均为（47.0±14.1）%。见表2。

2.4  超高液相色谱指纹图谱测定

2.4.1  色谱条件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;以0.1%磷酸为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱（0～5 min，90%～83%A;5～6 min，83%～80%A;6～15 min，80%～70%A;15～16 min，70%～20%A;16～19 min，20%A）;流速：0.3 mL/min;检测波长：210 nm;柱温：40 ℃;进样量：1 μL。

2.4.2  方法学考察

2.4.2.1  精密度试验

取同一供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样6次，结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.2.2  重复性试验

取同一样品，按“2.1.3.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件测定，结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明本方法重复性良好。

2.4.2.3  稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h按“2.4.1”项下色谱条件测定，结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3  指纹图谱采集与分析

分别精密吸取15批夏枯草标准汤剂供试品溶液1 μL，注入超高效液相色谱仪，按“2.4.1”项下色谱条件测定，得到标准汤剂的UPLC指纹图谱，见图1。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件进行色谱峰匹配，计算相似度，结果见表3。15批标准汤剂指纹图谱的相似度均在0.95以上。经比较分析，确定共有7个共有峰，以迷迭香酸峰（6号）作为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，相对保留时间RSD<1.19%，相对峰面积RSD介于24.31%～50.12%。

采用相同方法采集夏枯草饮片的指纹图谱并进行相似度评价，色谱图见图2，相似度见表3。15批饮片指纹图谱的相似度均在0.90以上。经比较分析，确定共有7个共有峰，以迷迭香酸作为参照，各共有峰的相对保留时间RSD<1.35%，相对峰面积RSD介于21.39%～44.03%，说明不同产地、不同批次样品的成分含量差异较大

2.4.4  相关性分析

    将夏枯草饮片和标准汤剂对照指纹图谱进行对比，见图3。饮片与标准汤剂有6个共有特征峰，其中3号为咖啡酸，6号为迷迭香酸。采用相似度评价软件计算二者相似度，结果见表4。相似度>0.9，表明二者主要成分基本一致。

3  讨论

本试验所用15批夏枯草药材来源于6个不同产地，具有较好的代表性。本试验标准汤剂的制备参照《医疗机构中药煎药室管理规范》（国中医药发〔2009〕3号）和国家药典委员会公布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》，以出膏率、有效成分含量及转移率为指标，对夏枯草饮片标准汤剂制备工艺进行评价。15批标准汤剂中咖啡酸的转移率均>100%，可能在制备过程中存在物质转化，需要进一步研究。

本次含量测定及指纹图谱试验过程中分别考察了不同的流动相及检测波长，通过比较色谱峰数目、峰形及分离效果、出峰时间等因素确定最佳色谱条件。供试品制备方法分别考察了提取时间和提取溶剂对提取效果的影响，最终确定用50%乙醇超声10 min进行提取。

本试验明确了夏枯草标准汤剂制备工艺相应参数，并对15批夏枯草饮片及其标准汤剂中指标成分的含量及指纹图谱进行了相关性研究。从结果可以看出，标准汤剂与饮片的化学成分基本相同，通过标准化工艺制备的各批夏枯草标准汤剂具有较高的均一性，质量相对稳定，可作为配方颗粒质量控制的标准参照物。本试验建立的夏枯草饮片标准汤剂的制备方法稳定，可为夏枯草配方颗粒的研究及生产提供基本的数据支持。

参考文献：

[1] 陈士林，刘安，李琦，等.中药饮片标准汤剂研究策略[J].中国中药杂志，2016，41（8）：1367-1375.

[2] 刘安.中药饮片标准汤剂制备与质量标准研究方法概述[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（7）：1.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：280.

[4] 李芳，林丽美，李春.夏枯草化学成分研究概况[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（24）：270-273.

[5] 顾晓洁，钱士辉，李友宾，等.夏枯草的化学成分及药理作用研究进展[J].中国野生植物资源，2007，26（2）：5-7.

[6] 崔体圣，苗明三.夏枯草的化学、药理及临床应用探讨[J].中医学报， 2014，29（3）：386-388.

[7] 李良.夏枯草药理作用研究[J].中国现代医生，2013，51（4）：120-121.