张欣 倪健 郭琳 杜梓萱 王美玲 冷新 游龙泰 王允亮 李军祥 尹兴斌

摘要：目的  優选清肠温中颗粒中黄连、三七、青黛的最佳醇提工艺。方法  以黄连生物碱、三七皂苷和靛玉红的提取率为指标，采用正交试验考察乙醇提取工艺，采用单因素试验考察离心工艺和浓缩干燥工艺。结果  优选的工艺为：黄连、三七、青黛3味药加10倍量60%乙醇，加热回流提取3次，每次1.5 h，提取液过滤，滤液5000 r/min离心10 min或7000 r/min离心5 min，所得离心液80 ℃以下减压回收乙醇，浓缩成相对密度为1.15～1.30（60 ℃）的稠浸膏，50 ℃以下减压干燥，粉碎成细粉。结论  本研究确定的工艺稳定性好，合理可行，可为工业化生产提供参考。

关键词：清肠温中颗粒;正交试验;单因素试验;黄连生物碱;三七皂苷;靛玉红;提取纯化;浓缩干燥

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.016

中图分类号：R283.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2018）10-0073-06

Multi-index Optimization of Alcohol Extraction Process of Coptidis Rhizoma， Notoginseng Radix et Rhizoma and Indigo Naturalis in Qingchang Wenzhong Granules

ZHANG Xin^1，2， NI Jian¹， GUO Lin¹， DU Zi-xuan¹， WANG Mei-ling¹， LENG Xin¹， YOU Long-tai¹，WANG Yun-liang³， LI Jun-xiang³， YIN Xing-bin¹

1. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China; 2. Beijing Union Second Pharmaceutical Factory， Beijing 102600， China; 3. Dongfang Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China

Abstract： Objective To optimize the alcohol extraction process of Coptidis Rhizoma， Notoginseng Radix et Rhizoma and Indigo Naturalis in Qingchang Wenzhong Granules. Methods With the extraction rates of coptis alkaloids， panax notoginseng saponins and indirubin as indexes， Coptidis Rhizoma， Notoginseng Radix et Rhizoma and Indigo Naturalis adopted orthogonal test to optimize the alcohol extraction process and adopted the single factor test to investigate the centrifugation， concentration and drying process. Results The optimal process was： Coptidis Rhizoma， Notoginseng Radix et Rhizoma and Indigo Naturalis were extracted with 10 folds of 60% alcohol for 3 times， 1.5 hours for each time. The filtrate was centrifuged by the speed of 5000 r/min for 10 min or 7000 r/min for 5 min. The centrifugal fluid was concentrated to a relative density of 1.15–1.30 （60 ℃） by recycling alcohol below 80 ℃. Followed with the decompression drying below 50 ℃， the dry extract was crushed into fine powder. Conclusion The process is stable， reasonable and feasible， which can provide a reference for the mass production.

Keywords：Qingchang WenzhongGranules; orthogonal test; single factor test; coptis alkaloids; panax notoginseng saponins; indirubin; extraction and purification; concentration and drying

清肠温中方为北京中医药大学东方医院临床经验方，治疗寒热错杂型溃疡性结肠炎疗效显著。该方由黄连、青黛、三七、苦参等8味药组成，寒热平调，理气活血，清热止血，以清肠治其标，温中治其本，能促进结肠黏膜修复和愈合^[1]，改善患者临床症状^[2]。

本方临床用药形式为汤剂，在口服、运输、贮存等方面有诸多不便。因此，本课题结合现代中药制剂工艺技术，对其制剂工艺进行优选，拟制成颗粒剂，以提高其方便性和稳定性，也为该临床经验方制备成医院制剂或中成药提供研究基础。根据方中各药味药理作用和成分的性质，设计黄连、三七、青黛采用乙醇回流提取，其余药味采用水提醇沉工艺提取。本试验对黄连、三七、青黛的醇提工艺进行优化研究，力求最大程度提取有效成分，保证制剂质量和药效。

1  仪器与试药

FW-200型高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司），KQ3200DE型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司），ZDHM型调温电热套（北京市中兴伟业仪器有限公司），TDL-5型台式离心机（上海安亭科学仪器厂），DZKW-4型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司），DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），JY5002型电子天平（上海衡平仪器仪表厂，0.01 g），CPA225D型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，0.01 mg），RE-52A型旋转蒸发器（上海振捷实验设备有限公司），LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司，SPD-20A DAD检测器，LC Solution色谱工作站），Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）。

黄连（批号501002642）、三七（批号401003991），北京同仁堂药材有限责任公司;青黛（批号1504019），北京琪景饮片厂。表小檗碱对照品（批号H25F3X1），上海源叶生物科技有限公司;黄连碱对照品（批号3022/17817），月旭材料科技（上海）有限公司;盐酸巴马汀对照品（批号110732-201510）、盐酸小檗碱对照品（批号110713-201212）、三七皂苷R1对照品（批号110745-201318）、人参皂苷Rg1对照品（批号110703-201530）、人参皂苷Rb1对照品（批号110704- 201424）、靛玉红对照品（批号110717-200204），中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯，Fisher公司;试验用水为高纯水，其他化学试剂均为分析纯。

2  方法与结果

2.1  指标成分含量测定

2.1.1  靛玉红含量测定

2.1.1.1  对照品溶液的制备

取靛玉红对照品适量，精密称定，加N，N-二甲基甲酰胺制成每1 mL含0.004 14 mg的溶液，即得。

2.1.1.2  供试品溶液的制备

按处方比例称取饮片适量，加入规定倍量、规定浓度的乙醇进行加热回流提取，至规定时间及次数，过滤，合并滤液，定容于1000 mL容量瓶中，加相应浓度乙醇至刻度，摇匀。精密量取5 mL于10 mL量瓶中，加相应浓度乙醇至刻度，摇匀，取少量，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.1.3  阴性对照溶液的制备

按处方比例称取除青黛外的饮片，按“2.1.1.2”项下方法制备，即得。

2.1.1.4  色谱条件

采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（70∶30），柱溫30 ℃，检测波长292 nm，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。色谱图见图1。

2.1.2  三七皂苷含量测定

2.1.2.1  对照品溶液的制备

取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含0.108 38、0.431 36、0.421 28 mg的混合对照品溶液，即得。

2.1.2.2  供试品溶液的制备

同“2.1.1.2”项。

2.1.2.3  阴性对照溶液的制备

按处方比例称取除三七外的饮片，按“2.1.2.2”项下方法制备，即得。

2.1.2.4  色谱条件

采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～60 min，18%A;65～75 min，28%A;95～100 min，32%～95%A;105～135 min，18%A）;流速：1.0 mL/min;柱温：30 ℃;进样量：对照品溶液5 μL，供试品溶液10 μL。色谱图见图2。

2.1.3  黄连生物碱含量测定

2.1.3.1  对照品溶液的制备

取表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含0.021 44、0.040 80、0.020 07、0.080 93 mg的混合对照品溶液，即得。

2.1.3.2  供试品溶液的制备

除“精密量取5 mL于25 mL量瓶中”外，其他操作同“2.1.1.2”项。

2.1.3.3  阴性对照溶液的制备

按处方比例称取除黄连外的饮片，按“2.1.3.2”项下方法制备，即得。

2.1.3.4  色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液=50∶50（每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0）;流速：1.0 mL/min;进样量：10 μL。色谱图见图3。

2.2  乙醇回流提取工艺考察

2.2.1  三七粒度考察

因三七质地坚硬，不易煎煮，故对三七的粉碎粒度进行考察。取三七药粉（最粗粉、粗粉、中粉各2份）12 g，加60%乙醇回流提取3次，每次1.5 h（每次加300 mL），提取液过滤，放冷，转移至1000 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀。精密量取5 mL至10 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，测定三七皂苷含量。结果不同粉碎粒度三七中三七皂苷含量为：粗粉>最粗粉≈中粉。粗粉与其他两者相比，提取量无明显提高，见表1。因此，考虑到最粗粉较粗粉来说，煎煮时不易糊化，且过滤相对较易，确定三七在提取时选择粉碎成最粗粉（过1号筛）。

2.2.2  单因素试验考察醇提浓度

按处方比例称取青黛、三七、黄连饮片4份，每份30 g，固定提取次数为2次，每次溶剂量为12倍量，每次提取时间为2 h，分别采用50%、60%、70%、80%乙醇进行提取，考察不同乙醇浓度对指标成分提取率的影响，确定合适的醇提浓度。结果乙醇浓度越高，靛玉红提取率越大，乙醇浓度为60%、70%时，靛玉红提取率已达到80%以上;乙醇浓度在60%、70%、80%时，对三七和黄连的提取率影响不大（见表2）。综合3个指标，考虑到大生产低能高效的要求，确定提取溶剂为60%乙醇。

2.2.3  醇提工艺正交试验

根据单因素试验结果，固定提取溶剂为60%乙醇，选取提取次数（A）、提取时间（B）、溶剂倍量（C）为影响因素，每个因素设3个水平，采用L₉（3⁴）正交试验设计，优选最佳醇提工艺，因素水平见表3。按处方比例称取黄连、三七、青黛饮片共9份，每份30 g，按表3安排进行试验。采用SAS8.0统计软件对数据进行处理，直观分析结果见表4，方差分析结果见表5～表7。

从直观分析可以看出，3个指标的最佳工艺均为A₃B₃C₃。根据方差分析结果，仅A因素对靛玉红提取率有显著影响（P<0.05），各因素对三七皂苷提取率均无显著影响（P>0.05），各因素对黄连生物碱提取率均有显著影响（P<0.05），A因素3个水平之间的差异较大，B因素的差异主要在B₁与B₂、B₃之间，C因素的差异主要在C₁與C₂、C₃之间，故B因素选择B₂水平，C因素选择C₂水平。优选的醇提工艺条件为A₃B₂C₂，即加60%乙醇加热回流提取3次，每次1.5 h，每次加10倍量溶剂。

2.2.4  醇提工艺验证试验

按处方比例称取3份饮片，每份含黄连、三七、青黛共30 g，按优选工艺A₃B₂C₂进行验证试验，结果见表8。可见，优选的工艺重复性好，稳定可行。

2.3  纯化工艺考察

醇提药物中，青黛为极细粉，可过200目筛，普通的过滤装置无法将其除去，影响后续成型工艺颗粒的溶化性，故需对离心工艺进行考察。

2.3.1  离心转速考察

按处方比例称取三七、黄连、青黛共30 g，按优选工艺A₃B₂C₂进行提取，精密移取提取液4份，每份100 mL，分别于3000、5000、7000、9000 r/min离心10 min，优选最佳的离心转速，结果见表9。在所考察的转速条件下，指标成分含量几乎无损失，结合滤纸截留残渣及沉淀紧实情况，确定离心10 min，转速在5000 r/min以上均可达到固液分离要求。

2.3.2  离心时间考察

考察5000 r/min和7000 r/min转速条件下不同离心时间的影响，结果见表10。离心时间对指标成分的含量影响不大，结合滤纸上截留残渣及沉淀紧实情况，建议选用的离心参数为5000 r/min离心10 min或7000 r/min离心5 min。

2.4  浓缩干燥工艺考察

2.4.1  浓缩温度考察

按处方比例称取三七、黄连、青黛共720 g，按优选的提取工艺和离心工艺制得离心液，搅拌均匀。精密量取离心液1000 mL共3份，分别于60、70、80 ℃条件下减压浓缩成相对密度为1.15～1.20（60 ℃）的药液，放冷，加60%乙醇复溶至1000 mL，玻璃棒搅拌均匀。精密量取5 mL至10 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，测定靛玉红和三七皂苷含量;精密量取5 mL至25 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，测定黄连生物碱含量。计算不同温度浓缩前后各指标成分的损失率，结果见表11。不同温度条件下减压浓缩，各成分损失率约为4%～6%，浓缩温度在60～80 ℃均可。

2.4.2  浓缩相对密度考察

按处方比例称取三七、黄连、青黛共720 g，按优选的提取工艺和离心工艺制得离心液，搅拌均匀。精密量取离心液3000 mL共3份，分别于80 ℃减压浓缩成相对密度为1.15～1.20（60 ℃）、1.20～1.25（60 ℃）、1.25～1.30（60 ℃）的药液，放冷，加60%乙醇复溶至3000 mL，用玻璃棒搅拌均匀。精密量取5 mL至10 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，测定靛玉红和三七皂苷含量;精密量取5 mL至25 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，测定黄连生物碱含量。计算不同相对密度条件下各指标成分的损失率，结果见表12。药液浓缩至不同相对密度后，指标成分的保留率均在90%以上。因此，药液减压浓缩至相对密度1.15～1.30（60 ℃）均可。

2.4.3  干燥温度考察

按处方比例称取三七、黄连、青黛共720 g，按优选的提取工艺和离心工艺进行试验，将所得离心液浓缩成相对密度为1.25～1.30（60 ℃）的药液。称取药液4份，每份约30 g，分别于50、60、70、80 ℃条件下减压干燥（-0.06～-0.1 MPa），得干浸膏。干浸膏加60%乙醇复溶至3000 mL，用玻璃棒搅拌均匀。精密量取5 mL至10 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，测定靛玉红和三七皂苷含量;精密量取5 mL至25 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，测定黄连生物碱含量。计算不同温度下干燥前后各指标成分的损失率，结果见表13。对于靛玉红，干燥温度为50 ℃时成分无损失，60～80 ℃时损失率高达50%以上;对于三七皂苷，4个温度条件下损失均较低;对于黄连生物碱，50～70 ℃时损失率较低，80 ℃时损失达20%以上。综合3个指标，确定温度在50 ℃时对3个指标成分都有较好的保留。

3  讨论

现代研究表明，黄连生物碱、三七皂苷和靛玉红具有很好的抗炎、抗病毒、抗肿瘤作用^[3-6]。本研究以其为指标成分，符合中药复方多成分、多指标评价思路，客观反映了提取工艺的优劣。在综合评价时，由于加权方法容易加强或抵消某些成分的贡献作用，故未选用多指标加权方法，而采用直观比较方法。

2015年版《中华人民共和国药典》载，青黛“1～3 g，宜入丸散用，外用适量”^[7]。闵志强等^[8]对青黛不宜入汤剂进行了考证，认为青黛易浮于水面、有效成分难以溶出、影响其他药味成分煎出、过滤困难等。且清肠温中方青黛日用量为3 g，冲服时对咽喉刺激性强。本研究尝试寻找既利于有效成分提取又经济省时的方法。有研究表明，使用含羟基的润湿剂乙醇可增大青黛中靛玉红的溶出度，将青黛与黄连一起乙醇回流提取，靛玉红的提取率均较高^[9-11]。故确定青黛与黄连、三七三者一起进行乙醇回流提取。

为了除去提取过程中普通过滤难以除去的青黛细粉，本试验对离心工艺进行了考察。为安全起见，待离心药液的乙醇含量不宜太高。本试验醇提部分药液乙醇浓度在60%左右，不宜直接离心，故需对醇提液适当浓缩以降低乙醇含量，有待后续研究。

本试验考察了50、60、70、80 ℃的干燥效果，50 ℃时干燥最慢但指标成分基本无损失，60、70、80 ℃干燥时间较短，但靛玉红损失率约为50%。徐德然等^[12]研究了板蓝根提取纯化及浓缩干燥工艺，结果靛玉红60 ℃比40 ℃损失了约20%，80 ℃比40 ℃损失了近50%，认为浓缩体积和干燥温度对靛玉红含量有显著影响。笔者认为，靛玉红在干燥过程中的损失不仅受温度影响，也受浸膏体积、真空度影响，这些因素又影响了干燥时间，是各因素综合作用的结果。理论上，靛玉紅含量在50～60 ℃应出现逐渐减少的趋势，因本试验选择间隔温度点进行考察，故未能得到相应数据。鉴于此，对于受温度影响较大的成分，在进行干燥处理时，必须将干燥体积和干燥时间等因素考虑在内，才能得出更加可靠的结论。

参考文献：

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