谭谦 曾肆 童妍

摘要：目的  观察大黄素甲醚对皮质酮损伤PC12细胞的影响。方法  体外培养PC12细胞，皮质酮处理后给予大黄素甲醚干预。采用CCK-8法检测皮质酮毒性及大黄素甲醚作用于皮质酮损伤后PC12细胞存活率;流式细胞仪检测PC12细胞凋亡;氮蓝四唑还原法检测PC12细胞内活性氧（ROS）水平;Western blot测定PC12细胞内脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白表达。结果  与空白组比较，模型组PC12细胞活力明显降低（P<0.01）;与模型组比较，大黄素甲醚组PC12细胞活力增强，PC12细胞凋亡率降低，PC12细胞内ROS含量降低，PC12细胞内BDNF蛋白表达升高。结论  大黄素甲醚对皮质酮诱导的PC12细胞损伤具有保护作用。

关键词：大黄素甲醚;PC12细胞;神经毒性;细胞活力;活性氧;脑源性神经营养因子

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.010

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2018）10-0040-04

Study on Protective Effects of Physcion on PC12 Cells Injured by Corticosterone

TAN Qian， ZENG Si， TONG Yan

College of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China

Abstract： Objective To observe the effects of physcion on PC12 cells injured by corticosterone. Methods PC12 cells were cultured in vitro， and the cells were treated with physcion after corticosterone intervention. CCK-8 was used to detect corticosterone toxicity and the survival rate of PC12 cells injured by corticosterone after treated by physcion. The apoptosis of PC12 cells was detected by flow cytometry. The level of intracellular ROS was determined by NBT reduction assay. BDNF protein expression in PC12 cells was detected by Western blot. Results Compared with the blank group， the viability of PC12 cells in the model group decreased （P<0.01）; Compared with the model group， the viability of PC12 cells increased， apoptosis rate of PC12 cells decreased， ROS content in PC12 cells decreased， and BDNF protein expression in PC12 cells increased in the physcion group. Conclusion Physcion has protective effects on corticosterone-induced PC12 cellular damage.

Keywords： physcion; PC12 cells; neurotoxicity; cell viability; ROS; BDNF

抑郁癥是一种以显著而持久的心境低落为主要临床表现的精神疾病，严重者伴有自杀倾向，发病率呈逐年上升态势。然而，现今主流的抗抑郁药物都有很大的局限性，而中医治疗抑郁症则由于受众广、见效快而备受关注，近年来相关基础与临床研究也取得了相应的进展^[1]。大黄素甲醚（physcion）属蒽醌类化合物，是大黄的主要成分之一。现代药理研究显示，大黄素甲醚具有抗抑郁作用^[2]，对急性肝、脑损伤具有保护作用^[3]，还可以抗肿瘤^[4]，能有效抑制神经细胞凋亡^[5]。本实验以大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞PC12细胞为研究对象，采用体外培养，以皮质酮（Cort）损伤PC12细胞构建抑郁症高皮质酮血症体外模型，探究大黄素甲醚对抗Cort神经毒性的作用及可能的机制。

1  材料与方法

1.1  药物和细胞株

大黄素甲醚、PC12细胞，成都里来生物医学实验中心提供。

1.2  主要试剂与仪器

南美胎牛血清（FB15011），美国CLARK公司;胰酶（J15003），美国HyClone公司;RPMI1640培养基（SH30809.01），美国HyClone公司;双抗（sv30010），美国HyClone公司;CCK-8检测试剂盒（BS350B），中国Biosharp公司;Cort（50-22-6），中国Meryer公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒（KGP903），南京凯基生物公司;预染蛋白Marker（00215343），美国NEB公司;ECL发光试剂盒（BL520A），美国Thermo公司;PVDF膜，美国Hybond公司;脑源性神经营养因子（BDNF）抗体（ab108319），英国Abcam公司;生物素化山羊抗兔IgG（ab6721），英国Abcam公司。CO₂培养箱（三洋电机国际贸易有限公司），倒置生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司），垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司），DYY-6C电泳仪（美国Bio-Rad公司），凝胶扫描成像仪（美国Bio-Rad公司），MDF-U50V型超低温冰箱（日本Sanyo公司），TGL-16G-A型高速低温离心机（上海安亭科学仪器厂），Image Lab凝胶分析系统（美国Bio-Rad公司）。

1.3  细胞培养

PC12细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养，半保留换液，每2 d传代1次。

1.4  CCK-8法检测皮质酮毒性

取培养至对数生长期的PC12细胞，接种于96孔板中，细胞数为1×10⁵个/孔，置于培养箱中培养48 h，使其贴壁。弃上清液，加入含不同浓度Cort的新鲜培养基。Cort浓度分别为0.2、0.4、0.8 mmol/L，每组设3个复孔。培养24 h后，每孔加10 μL CCK-8，再培养3 h，于波长450 nm处测定吸光度。

1.5  CCK-8法检测PC12细胞活力

选择对数生长期PC12细胞，用RPMI1640培养基调整细胞浓度至3×10⁴/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，每组设3个复孔，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中孵育过夜，使其贴壁。设置对照组、模型组（Cort浓度分别为0.2、0.4、0.8 mmol/L）、实验组（大黄素甲醚低、中、高剂量组，浓度分别为2、4、6 μg/mL），各模型组加入相应浓度Cort 100 μL造模24 h后，再分别按低、中、高剂量给药处理24 h。最后每孔加入10 μL CCK-8，培养3 h，于波长450 nm处测定吸光度。

1.6  流式细胞仪检测PC12细胞凋亡

培养瓶接种PC12细胞，按分组予不同浓度（Cort 0.4 mmol/L，Physcion 4 μg/mL，Cort 0.4 mmol/L+Physcion 4 μg/mL）药物处理24 h后，胰酶消化，离心，弃上清液，PBS吹洗1次，再次离心，弃去PBS，EP管收集细胞，于4 ℃预冷的70%乙醇中固定，-20 ℃贮存1～3 d。检测时，用含碘化丙啶染料制成1×10⁶/mL的细胞悬液，4 ℃避光30 min，流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.7  氮蓝四唑还原法检测PC12细胞内活性氧水平

将PC12细胞均匀接种到96孔板中，每孔200 μL，每组设3个复孔，待贴壁长满70%～80%，按分组给予不同浓度药物处理，在5%CO₂、37 ℃培养24 h后弃去培养液，每孔加氮蓝四唑100 μL，继续培养2 h，PBS冲洗2次，每孔加入2 mol/L KOH 100 μL及DMSO 100 μL，于波长570 nm处测定吸光度。

1.8  Western blot检测PC12细胞脑源性神经营养因子的蛋白表达

按实验分组予不同浓度（Physcion 2、4、6 μg/mL，Cort 0.4 mmol/L，Cort 0.4 mmol/L+Physcion 4 μg/mL）药物处理后提取细胞总蛋白，SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的1×TBST封闭。分别加入BDNF、β-actin一抗，孵育过夜，洗涤后加HRP标记的山羊抗兔IgG（二抗）。暗室内ECL法检测目的条带，胶片曝光，显影，以β-actin为内参分析结果。

1.9  统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1  皮質酮对PC12细胞活力的影响

与空白组比较，经Cort处理24 h后PC12细胞存活率呈浓度依赖性降低（P<0.01），见图1.

2.2  大黄素甲醚对不同浓度皮质酮损伤PC12细胞活力的影响

与空白组比较，低浓度Cort模型组细胞活力明显降低（P<0.01）;与模型组比较，大黄素甲醚中、高剂量组细胞活力增强（P<0.05，P<0.01），见图2A。与空白组比较，中浓度Cort模型组细胞活力显著降低（P<0.01）;与模型组比较，大黄素甲醚中、高剂量组细胞活力显著增强（P<0.05，P<0.01），见图2B。与空白组比较，高浓度Cort模型组细胞活力显著降低（P<0.01）;与模型组比较，大黄素甲醚高剂量组细胞活力显著增强（P<0.05），见图2C。与空白组比较，细胞活力与Cort呈浓度依赖性降低（P<0.01）;大黄素甲醚中剂量组能改善0.2、0.4 mmol/L Cort损伤后细胞活力（P<0.05），见图3。

2.3  大黄素甲醚对皮质酮诱导PC12细胞凋亡的影响

与0 mmol/L Cort比较，Cort可使PC12细胞凋亡率明显上升（P<0.01），单用大黄素甲醚对细胞凋亡率无显著影响;与0.4 mmol/L Cort比较，大黄素甲醚预处理后PC12细胞凋亡率显著降低（P<0.01）。结果见图4。

2.4  大黄素甲醚对皮质酮诱导PC12细胞活性氧水平的影响

与空白组比较，模型组PC12细胞ROS水平显著升高（P<0.01）;与模型组比较，大黄素甲醚中、高剂量组PC12细胞ROS水平显著降低（P<0.01）。结果见图5。

2.5  大黄素甲醚对PC12细胞内脑源性神经营养因子蛋白表达的影响

与空白组比较，大黄素甲醚低、中、高剂量组PC12细胞BDNF蛋白表达显著升高（P<0.01），见图6。与0 mmol/L Cort比较，大黄素甲醚能升高PC12细胞BNDF的蛋白表达，Cort能抑制BDNF的蛋白表达（P<0.01）;与0.4 mmol/L Cort比较，大黄素甲醚预处理后PC12细胞BDNF蛋白表达显著升高（P<0.01），见图7。

3  讨论

本课题组前期实验显示，外源性给予大黄素甲醚可改善慢性不可预见应激模型大鼠的抑郁样行为^[6]。PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的细胞株，其分化后形态和功能与神经内分泌细胞相似，其细胞膜上糖皮质激素（GC）受体表达丰富。研究表明，抑郁症患者下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能亢进，其持续反复激活会导致血中GC显著升高^[7-8]。有研究认为，GC水平升高与抑郁症的严重程度有关^[9]。而GC在啮齿类动物主要以Cort为主要形式存在。因此，本研究以高浓度Cort损伤PC12细胞模拟抑郁症患者GC损伤脑神经元状态，构建抑郁症高皮质酮血症体外模型，并用大黄素甲醚进行干预。结果显示，大黄素甲醚能显著改善Cort损伤后PC12细胞的存活率和凋亡率，减轻Cort对细胞产生的毒性。

Cort神经毒性可诱发氧化应激损伤，促使细胞凋亡^[10]。本实验结果显示，中、高浓度大黄素甲醚可显著减少PC12细胞氧化应激后细胞内ROS含量。

BDNF广泛分布于中枢神经系统中，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，是神经元维持正常生理功能所必须。有研究认为，神经可塑性及细胞再生能力的损伤可能是加重抑郁发病的病理生理基础^[11]。临床研究发现，抑郁症患者海马、前额叶皮层BDNF水平及外周血清、血浆中BDNF水平均明显减少^[12]，有研究报道，高浓度GC会抑制包括BDNF在内神经营养因子的表达^[13]，尤其在海马区^[14]。本研究结果显示，大黄素甲醚呈剂量依赖性提高PC12细胞内BDNF的表达，且可显著拮抗Cort对PC12细胞BDNF表达的抑制作用。

综上，可推测由抑郁症引起的慢性应激所导致的抑郁症患者体内HPA轴持续激活状态下，脑内高浓度GC会抑制BDNF等神经营养因子的正常表达，从而加剧海马神经元的增殖和再生障碍及其损伤后的再修复功能，最终加剧抑郁症的病情。本实验结果表明，大黄素甲醚可保护PC12细胞，上调PC12细胞BDNF的表达，并逆转Cort对BDNF表达的抑制效应。提示大黄素甲醚抗抑郁效应可能与其调控BDNF表达有关，其具体作用机制还有待进一步探索。

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