王萌 张会存 刘欣 汪红兵

摘要：目的  观察参苓白术散对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型大鼠血脂、瘦素和胰岛素抵抗的影响，探讨其相关作用机制。方法  20只实验大鼠随机分为正常组5只（正常饲料喂养）和高脂饮食组15只，高脂饮食组大鼠给予高脂饲料喂养制作NAFLD模型，将成模大鼠随机分为模型组、参苓白术散组和吡格列酮组，每组5只，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，参苓白术散组给予参苓白术散水煎液灌胃，吡格列酮組给予吡格列酮混悬液灌胃。药物干预8周后进行口服葡萄糖耐量实验，检测大鼠糖耐量变化及血清转氨酶、血脂、瘦素与胰岛素水平，并计算胰岛素抵抗指数。结果  与正常组比较，模型组大鼠血清转氨酶、血脂、瘦素、胰岛素、血糖和胰岛素抵抗指数均显著升高（P<0.05）;与模型组比较，参苓白术散组和吡格列酮组大鼠血清转氨酶、血脂、瘦素、胰岛素、血糖和胰岛素抵抗指数均显著降低（P<0.05）。结论  参苓白术散通过降低模型大鼠转氨酶与血脂水平发挥治疗NAFLD作用，其机制可能与调节瘦素、改善胰岛素抵抗有关。

关键词：参苓白术散;胰岛素抵抗;瘦素;血脂;肝功能;大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.009

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2018）10-0035-05

Effects of Shenling Baizhu Powder on Leptin and Insulin Resistance ofNon-alcoholic Fatty Liver Disease Rats

WANG Meng¹， ZHANG Hui-cun²， LIU Xin²， WANG Hong-bing²

1. Medical School of Xianyang Vocational Technical College， Xianyang 712000， China; 2. Beijing Traditional Chinese Medicine Hospital， Capital Medical University， Beijing Institute of Chinese Medicine， Beijing 100010， China.

Abstract： Objective To observe the effects of Shenling Baizhu Powder on blood lipid， leptin and insulin resistance of non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） rats; To explore its mechanism. Methods Twenty rats were randomly divided into normal group （normal diet feed， n=5） and high-fatdiet group （high-fat diet feed， n=15）. Rats of high-fat diet group were fed with high-fat diet to establish NAFLD model. Model rats were divided into model group， Shenling Baizhu Powder group and pioglitazone group， with 5 rats in each group. Normal group and model group were given normal saline for gavage， while Shenling Baizhu Powder group and pioglitazone group were given Shenling Baizhu Powder and pioglitazone suspension by intragastric administration respectively. After 8 weeks of medicine intervention， all rats were subjected to oral glucose tolerance test. Serum transaminase， blood lipid， leptin and insulin levels were detected by biochemical analysis. Insulin resistance index was calculated. Results Compared with the normal group， serum transaminase， blood lipid， leptin， insulin， blood glucose and insulin resistance index increased significantly in the model group （P<0.05）. Compared with the model group， serum transaminase， blood lipid， leptin， insulin， blood glucose and insulin resistance index in Shenling Baizhu Powder and pioglitazone group decreased significantly （P<0.05）. Conclusion Shenling Baizhu Powder can conduct treatment of NAFLD by reducing the effects of transaminase and lipid levels in model rats， and the mechanism may be related to the regulation of leptin and the improvement of insulin resistance.

   Keywords： Shenling Baizhu Powder; insulin resistance; leptim; blood lipids; liver function; rats

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fat liver disease，NAFLD）患病率逐年升高，已成为慢性肝病和肝酶学异常的首要病因。有研究表明，NAFLD相关肝硬化的肝癌发生率与丙型肝炎相关肝硬化的肝癌发病率接近^[1]。NAFLD是隐源性肝硬化的重要原因之一，由于该病患病率高，病变迁延，且危害大，是目前国内外肝病界研究的热点之一^[2-5]。研究发现，NAFLD伴有高胰岛素血症和胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），并与机体对瘦素的敏感性降低有关^[6]。白色脂肪分泌的多肽瘦素，其主要生理功能是调节糖脂代谢，主要影响机体摄食与能量代谢。当机体摄入脂肪时，机体分泌廋素增加，在下丘脑部位，通过JAK-STAT通路产生抑制神经肽Y，减少进食并兴奋交感神经分解脂肪，调控能量代谢。但在NAFLD病理状态下，瘦素异常导致高胰岛素血症，游离脂肪酸增加，肝脏分解脂肪酸失代偿，最终引起肝脏的脂质沉积，形成脂肪肝^[7]。瘦素可抑制胰岛素分泌，而当胰岛素分泌增多，可反馈性促进瘦素分泌，调控糖、脂代谢。但当瘦素与胰岛素之间的调节发生异常，IR发生，糖脂代谢发生紊乱，肝脏摄取过量的脂肪酸，脂肪在肝脏的异常堆积及炎性细胞聚集、浸润，导致NAFLD发生^[8-9]。有文献报道，参苓白术散可有效作用于糖尿病患者胰岛素信号通路，缓解其IR^[10-12]。本研究采用高脂饲料喂养制作NAFLD大鼠模型，观察参苓白术散对NAFLD大鼠IR与瘦素的影响，探讨其治疗NAFLD可能的作用机制。

1  实验材料

1.1  动物及饲料

清洁级SD大鼠20只，雄性，体质量110～120 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2009-0012。饲养于北京市中医研究所清洁级动物房。高脂饲料（蛋白质27.5%，碳水化合物65.8%，脂肪11.4% kCal/g），北京科澳协力饲料有限公司加工制作。

1.2  药物

参苓白术散（人参15 g，白术15 g，茯苓15 g，薏苡仁9 g，砂仁6 g，山药15 g，桔梗6 g，白扁豆12 g，莲子9 g，炙甘草9 g）^[13]，饮片由首都医科大学附属北京中医医院中药房提供，将上述饮片放入凉蒸馏水中，浸泡30 min，煎煮2次，将药汁混合后过滤，浓缩至每1 mL含原药材1 g，离心去掉残渣，4 ℃冰箱保存备用。吡格列酮片，天津武田药品有限公司，批号155A，使用前充分研磨，0.5%羧甲基纤维素纳溶液配制成作混悬液。用药剂量按实验动物与人体体表面积比等效量换算。

1.3  主要试剂与仪器

肝功能、血脂试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司），胰岛素放免试剂盒（北京华英生物），瘦素ELISA试剂盒（博奥森生物工程有限公司）。血糖仪（美国强生），7160全自动生化仪（日本日立），酶标仪（美国Bio-Rad），γ-911放射免疫分析仪（中国科技大学实业总公司）。

2  实验方法

2.1  分组、造模和给药

实验大鼠适应性喂养7 d，按随机数字表分为正常组、模型组、吡格列酮组、参苓白术散组，每组5只。参考文献[14-15]方法造模，正常组大鼠给予普通饲料喂养，其余3组大鼠饲喂高脂饲料，连续8周，制作大鼠NAFLD模型。参苓白术散组大鼠给予参苓白术散水煎液（12 g/kg）灌胃，吡格列酮组大鼠给予吡格列酮混悬液（4 mg/kg）灌胃，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积为5 mL/kg，每日1次，连续8周。

2.2  口服葡萄糖耐量实验

给药8周后，各组大鼠禁食12～14 h后，剪尾采血测定空腹血糖（FPG），然后以2 g/kg葡萄糖标准灌胃，分别于灌胃后60、120 min大鼠尾静脉取血检测血糖。

2.3  取材

给药8周后，予3%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，静置120 min，2000 r/min离心15 min，取血清，置于-20 ℃冰箱保存待测。

2.4  血清肝功能、血脂测定

取实验大鼠备用血清，分别与苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、L-天门冬氨酸，α-酮戊二酸、L-丙氨酸化学反应保温1 min，测定340 nm外吸光度，获得各组血清转氨酶值。使用7160全自动生化仪，按血脂试剂盒说明书测定大鼠三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。

2.5  血清胰島素测定

加入聚苯乙烯试管并相应编号后，分别加各组实验大鼠血清及标准品各100 μL，各管分别加入胰岛素抗体100 μL与I¹²⁵标记胰岛素100 μL， 4 ℃混匀，反应24 h;加分离剂500 μL，4 ℃、3500 r/min离心15 min，吸弃上清液，应用γ-911放射免疫分析仪自动检测沉淀的CPM值，并根据标准曲线计算各组大鼠血清胰岛素（FINS）水平。

2.6  血清瘦素测定

①将各种试剂移至室温平衡30 min，取浓缩洗涤液，根据当批检测数量，用蒸馏水1∶20稀释，混匀后备用。②标准品及质控品第1次使用前用0.5 mL蒸馏水溶解后充分摇匀，静置10 min后使用。③将预包被板从密封袋中取出，设空白对照孔，不加任何液体;每个校准点依次各设2孔，每孔加入相应标准品50 μL;其余检测孔直接加质控品或待测血清50 μL。然后各孔加入酶标抗体50 μL，充分混匀，贴上封板膜，置于37 ℃温育1 h。④手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置10 s甩干，重复3次后拍干;洗板机洗板：选择洗涤3次程序洗板后拍干。⑤每孔加显色剂A液50 μL，显色剂B液50 μL，振荡混匀，置于37 ℃避光显色15 min，每孔加终止液50 μL。⑥用酶标仪读数，先用空白对照孔调零点，然后测定各孔吸光度，计算样品浓度。

2.7  胰岛素抵抗指数计算

根据稳态模型HOMA，计算IR指数（HOMA-IR），HOMA-IR=FPG（mmol/L）×FINS（mIU/L）÷22.5。

3  统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料以 x（—）±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  参苓白术散对模型大鼠血清转氨酶水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，吡格列酮组和参苓白术散组大鼠血清ALT、AST水平均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

4.2  参苓白术散对模型大鼠血清血脂水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清TG、TC和LDL-C水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，吡格列酮组和参苓白术散组大鼠血清TG、TC与LDL-C水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），但对HDL-C影响不明显。结果见表2。

4.3  参苓白术散对模型大鼠血清胰岛素和瘦素水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清FINS、瘦素水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，吡格列酮组和参苓白术散组大鼠血清FINS、瘦素水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3。

4.4  参苓白术散对模型大鼠口服葡萄糖耐量实验的影响

与正常组比较，模型组大鼠血糖60、120 min时均升高，120 min时血糖差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，吡格列酮组和参苓白术散组大鼠血糖60 min变化不明显，120 min时吡格列酮组和参苓白术散组血糖明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表4。

4.5  参苓白术散对模型大鼠胰岛素抵抗指数的影响

与正常组比较，模型组大鼠HOMA-IR明显升高（P<0.05）;与模型组比较，吡格列酮组和参苓白术散组大鼠HOMA-IR显著降低（P<0.05）。结果见表5。

5  讨论

NAFLD患者肝脏存在IR，构成了NAFLD的发病基础并与NAFLD的病情进展紧密关联^[16]。瘦素是由机体的肥胖基因（Ob基因）经转录翻译表达形成的脂肪源性激素，该激素通过分布于中枢与外周的瘦素受体蛋白，调控脂肪代谢及能量消耗^[17]，当NAFLD瘦素水平异常升高可导致IR，该生理现象称为瘦素抵抗，IR和瘦素抵抗共同促进了NAFLD疾病的发生与发展。瘦素抵抗在NAFLD发病中具有重要作用^[18-19]。NAFLD患者表现出血清瘦素水平升高与瘦素抵抗的病理表现，表明血清瘦素水平可帮助临床早期诊断NAFLD，临床实践中也发现，改善瘦素抵抗药物亦可改善IR，阻止NAFLD病情的发展，NAFLD患者瘦素水平与胰岛素抵抗指数呈独立正相关^[20]。

脂肪组织经胰岛素刺激后，高表达瘦素并控制饮食，当抑制胰岛素分泌，降低胰岛素，可显著减少瘦素的形成。同时瘦素可促进分解TG，形成游离脂肪酸（FFA），FFA影响肌肉对胰岛素的敏感及肝糖输出，并降低对胰岛素的灭活，FFA可刺激胰岛分泌胰岛素，形成高胰岛素血症与IR^[21-24]。

中医学认为NAFLD病因与嗜食肥甘厚味、多逸少劳有关，其病位在肝，与脾、肾等脏腑密切相关，由脾、肾、肝三脏功能失调，痰瘀互结，停积于肝所致。脾虚痰瘀为NAFLD主要病机。

参苓白术散中人参大补脾胃之气，白术、茯苓健脾渗湿，山药、莲子健脾兼以涩肠止泻，白扁豆、薏苡仁健脾化湿，砂仁芳香醒脾，畅达气机，桔梗通利水道、且能载药上行，炙甘草健脾和中，调和药性，诸药相合，可补脾胃祛痰饮，有效缓解機体水湿停聚，降低肝糖原的减少，改善糖代谢。本实验结果显示，NAFLD大鼠经高脂饲料诱导后，其肝功能和血脂出现异常，表明高脂饲料对肝脏造成一定损伤，NAFLD造模成功。口服葡萄糖耐量实验结果显示，葡萄糖灌胃大鼠120 min后检测发现，模型组大鼠血糖升高，表明高脂饲料对大鼠胰岛素信号通路产生影响，经参苓白术散和吡格列酮干预后，与模型组比较，各给药组大鼠120 min血糖显著降低，表明参苓白术散和吡格列酮均可显著改善高脂造成的糖耐量降低及其诱发的IR;NAFLD大鼠经吡格列酮和参苓白术散干预后，血脂、瘦素、血糖与HOMA-IR均显著改善。

综上，参苓白术散通过降低模型大鼠转氨酶与血脂水平发挥治疗NAFLD作用，其机制可能与调节瘦素、改善IR有关，其具体机制有待进一步深入研究。

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