陆悦倩，田 曼，王宏伟

(1.南京医科大学附属儿童医院，江苏 南京 210029；2.无锡市儿童医院，江苏 无锡 214000；3.南京大学医学院，江苏 南京 210093)

过敏性哮喘是儿童最常见的慢性过敏性疾病。该病是指以慢性气道炎症、气道高反应性、气道阻塞为特征的慢性疾病[1]。过敏性哮喘的发病主要与遗传因素、接触变应原(如螨虫、粉尘、花粉等)及某些促发因素(空气污染、吸烟、呼吸道感染)等有关。该病患儿若未能及时接受有效的治疗，可发生阻塞性肺气肿、慢性肺源性心脏病、呼吸衰竭等严重的并发症[2]。白细胞介素-6(IL-6)是一种促炎性细胞因子。sIL-6R是IL-6受体(IL-6R)经蛋白质水解后形成。有研究表明，sIL-6R与IL-6结合后，仍能介导IL-6的生物学功能。Treg是T淋巴细胞群中表达CD4、CD25、Foxp3等特异性表面标志物的淋巴细胞亚群，其可以有效地抑制自身反应性T细胞的功能及增殖。本文主要探讨sIL-6R与Treg在儿童过敏性哮喘发病机制中的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将在南京市儿童医院呼吸内科门诊接受治疗的214例过敏性哮喘患儿和同期在该医院外科接受疝囊高位结扎术的196例腹股沟斜疝患儿作为研究对象。将196例腹股沟斜疝患儿作为对照组，将214例过敏性哮喘患儿作为哮喘组。在对照组患儿中，有男84例，女112例；其年龄为4～13岁，平均年龄为(7.1±1.2)岁。在哮喘组患儿中，有男119例，女95例；其年龄为3～14岁，平均年龄为(7.2±1.9)岁。两组患儿的一般资料相比，P＞0.05，具有可比性。

1.2 研究对象的纳入标准及排除标准

研究对象的纳入标准是：1)哮喘组患儿的病情符合《实用儿科学》中关于哮喘的诊断标准，并被确诊。2)哮喘组患儿进行皮肤点刺试验的结果均为阳性。3)患儿的监护人同意让患儿参加本次研究，并签署了知情同意书。其排除标准是：合并有过敏性皮炎、过敏性紫癜、过敏性休克的患儿。

1.3 方法

对两组患儿均进行静脉采血。应用BioTEK酶标仪检测两组患儿血浆中IL-6、sIL-6R的水平。应用BioTEK酶标仪进行检测的方法是：1)采集两组患儿的静脉血4 ml。2)对两组患儿的静脉血进行离心处理，将离心机的转速设置为3000 r/min，将离心半径设置为10 cm。进行离心的时间为15 min。3)提取上清液。4)应用BioTEK酶标仪，按照IL-6 ELISA试剂盒(生产企业为北京翘神州生物技术有限公司；产品型号为SEK10398)及IL-6免疫测定试剂盒(生产企业为美国圣地亚哥eBioscience公司)的要求，采用ELISA法在2 h内对患儿血浆标本中IL-6、sIL-6R的水平进行检测。应用流式细胞技术检测两组患儿外周血中Treg的含量。检测的方法是：1)使用人淋巴细胞分离液通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从全血中分离出PBMC(Peripheral blood mononuclear cell，外周血单个核细胞)。2)将PBMC用2ml磷酸盐缓冲液洗涤两次，在450xg条件下离心5分钟后去除上清。3)以100ul磷酸缓冲溶液重悬细胞。4)加入CD4(FITC)、CD25(APC)荧光素标记的抗人抗体，黑暗条件下4℃孵育至少30分钟。5)将表面染色后的细胞直接加入1毫升的破膜/固定工作溶液(eBioscience公司)，黑暗条件下4℃孵育30min。6)无需洗涤，直接再加入2毫升1×破膜液(eBioscience公司)，在室温400g*5分钟下离心，洗涤、弃去上清液，细胞悬浮在200μL的PBS中，分装至100ul/管流式细胞仪检测管中。7)分别加入FoxP3荧光素标记的流式抗体和抗人的iso-型对照抗体，并在黑暗的室温环境中进行60min染色。8)最后用FACS溶解液(BD Pharmingen公司)洗涤并固定细胞，再次进行400g*5min离心处理。9)离心结束后，弃上清，加入0.5 ml的磷酸缓冲盐溶液，充分混匀后，应用流式细胞仪检测Treg的含量。

1.4 统计学处理

使用Flowjo 7.6.1软件对本次研究中的数据进行处理，计量资料用均数±标准差()表示，Treg的含量、sIL-6R的水平、IL-6的水平均采用t检验或非参数检验(Mann-Whitney U-test)，计数资料用百分比(%)表示，数值变量之间的相关性采用χ²检验。本次研究所得数据均符合Hardy-Weinberg平衡定律，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿血浆中IL-6、sIL-6R水平的比较

与对照组患儿相比，哮喘组患儿血浆中IL-6、sIL-6R的水平更高，P＜0.05，详见表1。哮喘组患儿血浆中IL-6、sIL-6R水平的异常升高与其机体内的炎症反应具有显著的相关性(R=0.23，P＜0.01)。详情见图1。

表1 两组患儿血浆中IL-6、sIL-6R水平的比较(pg/ml ，)

表1 两组患儿血浆中IL-6、sIL-6R水平的比较(pg/ml ，)

哮喘组(n=214)对照组(n=196) t值 P值IL-6的水平 41.30±3.52 26.50±2.14 3.538 0.0005 sIL-6R的水平 41940±1013 34010±108 5.276 ＜0.0001

2.2 两组患儿外周血中Treg含量的比较

与对照组患儿相比，哮喘组患儿外周血中Treg的含量更低，P＜0.01，详见表2。两组患儿血浆中IL-6的水平与其外周血中Treg的含量无相关性，但其血浆中sIL-6R的水平与其外周血中Treg的含量呈负相关(R=0.183，P＜0.01)。详情见图2。

表2 两组患儿外周血中Treg含量的比较(%，)

表2 两组患儿外周血中Treg含量的比较(%，)

对照组(n=196) 哮喘组(n=214) t值 P值Treg 5.509±0.1614 3.914±0.2240 5.605 ＜0.0001

图1 哮喘组患儿血浆中IL-6、sIL-6R的水平与其机体内炎症反应的相关性

图2两组患儿外周血中Treg的含量与其血浆中sIL-6R水平的关系

图2 A∶Treg表面标志物Foxp3(叉头盒蛋白P3)为阳性的CD25阴性细胞流式散点图(右上图)；哮喘组患儿外周血中Treg表面标志物CD25、Foxp3细胞流式散点图(右下图)；对照组患儿外周血中Treg表面标志物CD25、Foxp3细胞流式散点图(左下图)。图2B：两组患儿外周血中Treg的含量。图2C：两组患儿外周血中Treg的含量与其血浆中sIL-6R的关系。

3 讨论

IL-6是一种促炎性细胞因子。IL-6可由多种细胞合成，包括活化的T细胞和B细胞、单核-巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞及成纤维细胞等。有研究表明，IL-6在类风湿关节炎、多发性硬化症、哮喘、糖尿病和癌症等炎症性疾病的发病中可发挥重要的作用[2]。sIL-6R是一种分子量为50～60 kDa的细胞膜糖蛋白，其与IL-6结合后，仍能介导IL-6的生物学功能。临床实践证实，哮喘患儿在受到过敏原刺激后其肺泡灌洗液中sIL-6R的水平明显升高。Doganci A等[3]的研究表明，哮喘小鼠在受到过敏原刺激后其支气管肺泡灌洗液中sIL-6R的水平明显升高。由此可见，IL-6水平的异常升高与过敏性哮喘所致炎症反应具有显著的相关性。有研究表明，血浆IL-6、sIL-6R水平可直接反映过敏性哮喘患儿的慢性炎症过程。Treg具有显著的免疫调节作用，可有效地抑制自身反应性T细胞的活化和增殖。CD4、CD25、Foxp3均是Treg的表面标志物。有研究表明，哮喘小鼠体内的Treg可有效地抑制其气道炎症[4]。有研究表明，呼吸道病毒可通过双链RNA进行繁殖，诱导患者体内IL-6的水平异常升高，从而抑制Treg免疫调节的功能[5]。通过建立哮喘小鼠模型发现，其体内IL-6与sIL-6R结合后可抑制Treg的生成，当sIL-6R水平异常升高后， Treg的含量明显减少。本次研究的结果证明，可溶性白细胞介素-6受体水平的升高，调节性T细胞含量的降低均是导致儿童过敏性哮喘发病的危险因素。过敏性哮喘患儿血浆中sIL-6R的水平与其外周血中Treg的含量呈负相关。