李晓英 赵艳景 阎斌伦 董志国

（淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点实验室，连云港 222005）

蛋白质是生命体的基本组成物质，也是生命活动最终控制者和直接执行者，它几乎参与了所有生命活动，人类对于蛋白质的研究已经有一百多年的历史。蛋白层析系统是当前蛋白纯化工作中常见的一种设备，自动化程度较高，本文结合笔者多年使用该仪器的工作经验，以美国伯乐公司的Biologic Duoflow蛋白层析系统为例，对蛋白层析系统结构、工作原理、常用的蛋白分离方法及使用与维护手段进行详细介绍，旨在提升初学者使用该系统的能力，加强我国蛋白质分离技术。

1 Biologic Duoflow蛋白层析系统构造及工作原理

蛋白纯化系统由4部分构成，即梯度泵、混合器、检测器和组分收集器。Biologic Duoflow蛋白纯化系统的工作原理如图1所示。

图1 蛋白纯化系统工作原理

在蛋白纯化系统中，梯度泵是整个系统的心脏，实验所用的所有试剂、样品都是通过梯度泵进入到整个管路中进行分离的。混合器通常在进行离子交换层析时使用，它能将两种缓冲液按不同百分比进行配比。检测器是蛋白纯化系统的“眼睛”，它的检测波长范围为10～700nm，只要存在分离的蛋白质便能检测出来，然后在电脑记录仪上以洗脱峰形式呈现出来，同时将相关信息传导至组分收集器中。

2 几种常见的蛋白分离方法

2.1 亲和层析

亲和层析是利用生物大分子与某些相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的层析方法。该蛋白分离方法选择性强、纯化效率高，常常可以一步获得满意的纯化效果。但由于亲和层析法依赖的是生物学特异性而不是物理化学性质，故只适用于分离低浓度的待纯化蛋白质。

2.2 凝胶过滤层析

俗称分子筛，是利用具有多孔网状结构的颗粒的分子筛作用，根据被分离样品中各组分相对分子质量大小的差异进行洗脱分离的一项技术。利用凝胶过滤层析进行蛋白分离，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分子量早流出柱子，中等大小的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，而小蛋白质可以进入所有填料的孔内，有最大的通过体积。

2.3 离子交换层析

该方法主要是利用不同蛋白质表面电荷性质达到蛋白分离、纯化蛋白质的目的。分离柱的交换剂是由大量带电荷的侧链和不溶性树脂结合而成。蛋白溶液进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱，余下的蛋白质均结合在树脂上，但与树脂的亲和力又各不相同，此时可逐渐提升洗脱液中NaCl浓度，将其逐一洗脱出来，这样就达到了分离蛋白质的目的。

2.4 疏水作用层析

该方法以介质疏水基团和蛋白质疏水区域间的亲和作用为基础，可溶性蛋白质在外表面存在疏水小区，这些暴露的疏水区对疏水层析是非常理想的场所。溶液盐浓度增加时疏水作用变得更强，所以大多数疏水层析都是高盐时上样，降低盐浓度时洗脱。分离温和且分离蛋白质含量高，使疏水层析在蛋白质纯化中成为很有价值的一种技术方法。

3 Biologic Duoflow蛋白层析系统的保养与维护

为了确保系统的稳定运行，每次的开机顺序为：先开硬件系统，即按照梯度泵、检测器、混合器以及组分收集器顺次依次打开电源开关，待硬件系统稳定后，再打开电脑监视器的软件系统。

所有用于层析系统的水、缓冲液等试剂溶液，要和所有样品一样，在使用前通过0.45μm微孔滤膜过滤，并通过真空抽气装置或超声波对以上各试剂溶液和样品脱气，确保溶液和样品中无微颗粒或溶解气体。

实验之前要用配套的注射器对梯度泵进行真空抽气，操作的顺序为：先将注射器插入梯度泵的“Priming”接口，再旋松螺旋，抽出泵中的溶液，抽完之后先旋紧螺旋再拔注射器。重复上述操作数遍，直到抽出溶液不含气泡为止。

每次实验之前都要将阀门转到Purge位，冲洗梯度泵约2min左右，确保梯度泵内没有气体为止。用过滤脱气的超纯水冲洗梯度泵及其管道，再用针筒各抽取10ml超纯水打入泵上方的泵头冲洗入口，进行泵头清洗。若设备长时间停用，还要进行停用维护，操作顺序为：先对梯度泵进行真空抽气操作，然后用过滤脱气的20%乙醇溶液冲洗整个系统、阀门及其管道，并定期检查与维护。

4 应用实例

抑癌活性蛋白是当前研究的热点，缢蛏抗癌活性蛋白组分Y3就是缢蛏经缓冲液浸提后，利用Biologic Duoflow蛋白层析系统和DEAE纤维素离子交换层析，得到不同蛋白质组分，收集具有抑癌活性较强的峰3，如图2所示。

峰3经Sepharose CL-6B凝胶层析纯化，收集具有抑癌活性更强的峰3，简称Y3，如图3所示。

图2 DEAE离子交换图谱

图3 Sepharose CL-6B凝胶层析图谱