张佩伦 郭禄芹 胡倩梅 杨路明 马长生

摘要：为了快速高效地鉴定杂交种纯度，建立完善的西瓜杂交种纯度SSR分子标记鉴定技术体系。利用30对杂合率高、多态性高的SSR引物对‘豫艺360‘豫艺黑小宝‘国豫二号和‘甜王这4份在河南省广泛种植的西瓜杂交种父母本进行筛选，筛选出7对条带清晰、多态性较好的引物。通过PCR反应体系扩增及凝胶电泳进行纯度分析，对4份杂交种的F₁样本进行鉴定，纯度分别为91.1%、93.2%、92.6%、91.4%，将分子标记鉴定结果与田间形态学鉴定的结果相比对，两者偏差52%，在允许范围之内，表现出高度一致。

关键词：西瓜;SSR;分子标记;纯度鉴定

传统的形态学性状鉴定方法（即田间鉴定法）[1]存在费时费力，易受环境、气候及人为因素的影响等一系列弊端。分子标记从DNA水平上检测个体或种群间基因组中存在的某种差异，通过PCR反应体系扩增及凝胶电泳技术检测出个体间的差异，准确区分出纯合带型和杂交带型，从而快速高效地鉴定杂交种的纯度。王吉明等[Z]总结出了系统性的鉴别方法，李超汉等[3]针对不同的西瓜杂交种进行纯度鉴定和特异性分析。但由于西瓜遗传背景狭窄，不同品种之间的亲缘关系较近，分子标记多态性较低，会限制分子标记在纯度鉴定上的应用。笔者利用SSR分子标记技术，旨在找出适宜的SSR标记鉴定‘豫艺360‘豫艺黑小宝‘国豫二号‘甜王这4份在河南普遍种植的西瓜杂交种纯度，并通过田间形态学性状鉴定进行相互验证，进而可替代田间形态学性状检测方法[4]，建立高效的SSR分子标记鉴定杂交种纯度的体系。

1 材料与方法

1.1 供试西瓜杂交种

选择4份在河南省广泛种植，在各种性状上均具有代表性的优质西瓜商业杂交品种（表1），4份材料均由河南豫艺种业科技发展有限公司提供，分别为‘豫艺360‘豫艺黑小宝‘国豫二号和‘甜王。2017年5-8月在田间种植（河南农业大学扶沟蔬菜研究院试验基地）进行形态学性状鉴定试验，2017年9-12月在河南农业大学园艺学院分子实验室利用SSR分子标记进行杂交种的纯度鉴定。

1.2 SSR分子标记纯度鉴定方法

1.2.1 西瓜杂交种催茅与育苗 取每份杂交种的F₁及其父母本种子，分别育苗。温汤浸种10～15min，高锰酸钾5000倍液浸泡4h，常温浸泡4ho浸种后，将种子用湿毛巾包裹后置于培养箱中催芽，白昼时长14h，温度30℃，夜间时长10h，温度25℃，将种子放于吸水布上，并在种子上部覆盖吸水纸进行育苗。后期根据幼苗出苗情况除去子叶上部种皮，幼苗子叶展平后采样[5]。

1.2.2 提取供试杂交种F₁及父母本DNA 利用孫利萍等[5]的碱裂解法快速提取杂交种F₁DNA，利用CTAB法提取父母本的DNA.

1.2.3 PCR扩增及电泳检测 PCR体系为模板DNA2μL，引物1μL，Master Mix 5μL，ddH₂O2μL。PCR反应程序为95℃5min，94℃45s，58～68℃1min，6个循环，72℃1min，94℃30s，50～58℃1min，8个循环，72℃1min，94℃30s，50℃30s，20个循环，72℃1min，72℃7min，4℃保存。用30%（ω）聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物电泳90min，使用银染法进行染色，分析电泳结果[6]。

1.3 田间形态学性状鉴定方法

主要结合瓜胎和幼瓜果皮颜色2个形态指标，在坐瓜期和幼瓜期进行综合鉴定，将田间种植的纯度鉴定结果收集整理，与实验室的鉴定结果作比对[1]。

1.4 供试西瓜杂交种SSR分子标记引物的筛选

从Zhu等[7]设计的480对西瓜SSR引物中随机筛选出多态性高且杂合率高的30对引物用于本试验的纯度鉴定，用4份西瓜杂交种的亲本对这30对引物进一步筛选（图1），最后筛选出7对在4份杂交种中表现出较好多态性的引物（表2）。

2 结果与分析

2.1 SSR标记引物筛选结果

引物WMSSR09205适用品种较多，在‘豫艺360‘豫艺黑小宝和‘甜王3个杂交种均可以扩增出杂交或互补带型，可以鉴定杂交种的纯度。而引物WMSSR05567只适用于‘国豫二号的纯度鉴定，在其他品种的纯度鉴定条带中表现均无差异性。

2.2 SSR标记对西瓜杂交种的纯度鉴定

通过引物WMSSR29311对‘豫艺360杂交种的纯度检测（图2），结果显示在90个F₁单株中，有82个单株表型为父母本杂合带型，另外8个单株为母本纯合带型，因此该批样本的纯度鉴定结果为91.1%;利用引物WMSSR13827对‘豫艺黑小宝杂交种进行检测，结果显示在‘豫艺黑小宝的89个F₁单株中，有83个单株表型为父母本杂合带型，6个单株为母本纯合带型，纯度鉴定结果为93.2%;引物WMSSR09205对‘甜王杂交种纯度检测（图3），结果显示在93个F₁单株中，有85个单株表型为父母本杂合带型，8个单株为母本纯合带型，纯度为91.4%。

利用引物WMSSR05567对‘国豫二号进行纯度鉴定，结果显示在95个F₁单株中，有88个单株表型为父母本杂合带型，7个单株为母本纯合带型，故纯度为92.6%。

2.3 SSR标记与形态学性状纯度鉴定结果比对

利用田间形态学性状鉴定法进行田间鉴定，将得到的数据统一收集整理，与SSR分子标记鉴定结果进行对比（表3）。

将田间形态学性状纯度鉴定与SSR分子标记鉴定结果进行比对，发现两者的纯度偏差均符合允许的误差范围≤2%。导致田间纯度鉴定结果与SSR分子标记鉴定结果产生偏差的原因，可能是取样过程中没有做到完全随机或苗期长势较弱的植株（通常为母本）死亡，从而导致田间纯度鉴定结果高于SSR分子标记检测结果。

3 讨论

在利用分子标记对西瓜杂交种进行纯度鉴定中，首先面临的是引物筛选问题，需要找到可以将亲本与杂交一代鉴别开来、满足西瓜纯度鉴定的杂合率高和多态性高的核心引物。本研究中筛选出的引物在这4份西瓜杂交种中均表现良好，筛选出的特异性条带清晰，便于识别，方便对西瓜杂交种纯度进行分析。蒋莉莉等[8]也通过试验证明SSR分子标记技术进行室内鉴定的可行性，但筛选出的引物扩增产物大小比较接近，不利于多重PCR的扩增。刘子记等[9]则利用两对扩增产物大小相差100bp的两对引物进行多重PCR试验，证明其可行性，可以显著提高检测效率。而在本研究中除WMS-SR05567扩增产物在162bp，其他引物扩增产物均在210～270bp之间，下一步应筛选更多引物进行多重PCR试验。多重PCR技术高效、快捷且具有高度特异敏感性，可以同时对多个位点的变异情况进行检测，有利于加快纯度鉴定进程，建立标准化的鉴定程序。

对于因碱裂解法提取的DNA浓度较低、造成条带较弱或缺失的样本，应使用CTAB法提取高质量的DNA用于PCR的扩增。也可以增加电泳时的上样量，以便获得更加清晰、容易识别的条带。同时，点样时应注意经常更换枪头，避免样本间的串样和污染，影响电泳条带的显示结果。

本研究中每份西瓜杂交种都筛选出了多态性较好的引物，在检测自交苗的同时能将掺杂其中的其他品种植株鉴别开来。这些引物可以提高检测效率，确保结果的准确性，为今后形成SSR分子标记应用于西瓜杂交纯度鉴定的技术规程奠定研究基础。同时，西瓜SSR分子标记、西瓜表型的多样性分析[10]、西瓜种群分布的聚类分析[11]、抗病品种的选育[12]、遗传图谱的构建和相关性状的分析[13]等一系列研究工作，都对西瓜的产业发展起到了一定的推动作用。

4 结论

本研究结合4份在河南省广泛种植的西瓜杂交种作为供试样本，筛选出多态性较好的7对引物，适用于这4份西瓜杂交种。这些引物可以将西瓜杂交种之中的自交苗以及其他品种的异形株鉴别开来。其中引物WMSSR09205在‘豫艺360‘豫艺黑小宝‘甜王这3份西瓜杂交种样本中均具有良好的多态性，可作为鉴别这3个西瓜杂交种纯度的优质引物。通过利用SSR分子标记技术进行西瓜杂交种的纯度鉴定，与田间形态学性状鉴定结果比对，对两者结果进行显著分析，两者的纯度偏差均符合允许的误差范围≤2%，证明SSR分子标记技术检测西瓜杂交种纯度的方法可以替代田间形态学性状鉴定法。该技术可避免在杂交种纯度鉴定中传统田间形态学性状鉴定法的繁琐和不稳定，减少劳动量，消除人为主观判断对鉴定结果的影响，准确、快捷、科学的鉴定出杂交种纯度，具有更高的可信度。

参考文献

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