王 骞，张辉菊，杨 敏，张 华 ，周 浓，李 杨

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 404120；3.三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 404120；4.大理大学学报编辑部，云南大理 671003）

滇重楼（Parispolyphyllavar.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.）为百合科重楼属植物云南重楼的干燥根茎，具有清热解毒、消肿止痛等功效，在西南地区是著名的具有产业化利用主导地位的中药材，已被列为国家重点保护二级濒危药用植物〔1-3〕。随着市场需求量不断增加，供需矛盾日益突出，人工栽培技术虽不断提高，可在一定程度上缓解该矛盾，但仍存在入药质量不稳定等问题〔4-8〕。现有研究表明丛枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）真菌可以提高多数药用植物的产量和品质〔9-10〕，为解决入药质量不稳定这一问题，本研究通过对滇重楼根茎部位接种28种不同的AM真菌，探讨AM真菌对其侵染率和品质的影响，并筛选出可以提高其主要药用品质指标成分含量的AM真菌菌种，从而为人工栽培滇重楼施用生物肥料，提高入药品质提供科学理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1100 LC高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；DZF-6050MBE型电热恒温真空干燥箱（上海博讯实业有限公司）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RV 10 basic V型旋转蒸发仪（德国IKA集团）；SHZ-Ⅲ循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；CP225D型分析天平（德国Sartorius公司）；FZ102型微型植物试样粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.2 试药 薯蓣皂苷元对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：A0124，含量≥98%）；乙腈（色谱纯，美国Tedia试剂公司）；水为娃哈哈纯净水；其他所用试剂均为国产分析纯。

1.3 供试材料与培养 AM真菌均为AM真菌纯净菌剂（购于美国国际丛枝菌根真菌种质资源保藏中心），接种菌剂为带有菌丝、孢子及侵染后根段的栽培基质的混合物〔11-12〕。不同处理组接种AM 真菌种类为：Ga处理组（Gigaspora albida）、Gd处理组（G.decipiens）、Gg处理组（G.gigantea）、Gm处理组（G.margarita）、Gr处理组（G.rosea）、Sca处理组（Scutellospora calospora）、Sdi处理组（S.dipurpura-scens）、Spe处理组（S.pellucida）、Dh处理组（Dentiscutata heterogama）、Rco处理组（Racocetra coralloidea）、Rfu处理组（R.fulgida）、Sde处理组（Septoglomus deserticola）、Svi处理组（S.viscosum）、Cc处理组（Claroideoglomus claroideum）、Fm处理组（Funneliformis mosseae）、Rcl处理组（Rhizophagus clarus）、Rin处理组（R.intraradices）、Afo处理组（Acaulospora foreata）、Ako处理组（A.koskei）、Asc处理组（A.scrobiculata）、Asp处理组（A.spinosa）、De处理组（Diversispora eburnea）、Ds处理组（D.spurca）、Ec处理组（Entrophospora colombiana）、Pb处理组（Paraglomus brasilianum）、Po处理组（P.occultum）、Ale处理组（Ambispora leptoticha）、Atr处理组（Archaeospora trappei）〔13-14〕。

实验样品选自大理州农科院种植基地大小基本一致的滇重楼新鲜根茎，经重庆三峡学院周浓教授鉴定为百合科重楼属植物滇重楼P.polyphyllavar.yunnanensis。栽培袋用10%次氯酸钠溶液浸泡15 min后，用自来水冲洗干净。栽培基质为重庆三峡学院百安校区的菜园土与河沙的混合物（体积比为3：1，过2 mm筛后，在121℃的高压灭菌锅内灭菌2 h）。采用室温盆栽栽培的方法，设为AM组（接种28种AM真菌）和CK组（对照组），共29个处理组。每个处理组分别有6个平行，每盆栽种15株滇重楼。选择大小一致的滇重楼根茎，将菌土均匀施于滇重楼根茎部，接种剂量为每盆15 mL（每1 mL大约含有60个孢子）。接种后在室温（自然光照）条件下培养。生长期间，定期浇灌Hoagland营养液。

2 方法与结果

2.1 丛枝菌根对滇重楼根系菌根侵染率的影响随机选取滇重楼根系30条，剪成长约1.0 cm的根段，采用曲利本蓝染色法进行AM真菌的侵染率测定〔15〕。由图1可以看出，各处理组的滇重楼根系均被AM真菌侵染，并形成了丛枝菌根结构，但侵染强度却有所不同。同时，CK组滇重楼根系侵染率不为0.00%，可能是前期栽培土壤中含有一定量的真菌类群，致使滇重楼成年植株根系具有一定的菌根侵染，与周浓等〔8〕的研究结果一致。见图1。与CK 组相比，Gg、Gm、Sca、Spe、Dh、Rco、Rfu、Sde、Cc、Rin和Ds共11种AM真菌对滇重楼根系侵染率最高，在59.00%～75.40%，且这11种AM真菌侵染率差异无统计学意义（P＞0.05）；与CK 组相比，Ga、Gd、Svi、Afo、Ako、Asc、Asp、De、Ec、Pb、Po、Ale和Atr共13种AM真菌对滇重楼根系侵染率居中，在40.00%～50.00%，且这13种AM真菌侵染率差异无统计学意义（P＞0.05）；Gr、Sdi、Fm和Rcl共4种AM真菌对滇重楼根系侵染率最低，在25.40%～32.60%，且这4种AM真菌侵染率与CK组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，28组AM真菌都对滇重楼有一定的侵染。由此可见，接种外源AM真菌对滇重楼根内AM真菌的侵染率、侵染强度具有调控作用。

图1 接种不同AM真菌对滇重楼根系菌根侵染率的影响

2.2 丛枝菌根对滇重楼薯蓣皂苷元的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取薯蓣皂苷元适量用甲醇溶解，配成0.539 mg∕mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约0.250 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL甲醇，超声提取40 min，静置放冷，过滤，再加入20 mL甲醇，超声提取40 min，放冷，过滤，合并2次提取液，回收甲醇，残渣加入2 mol∕L盐酸7.5 mL，置于100℃水浴锅中水解2 h，冷却后萃取3次，每次用30 mL石油醚（60～90℃），萃取时间分别为45、40、30 min。合并3次萃取液，并回收石油醚至干，残渣用甲醇溶解至10 mL量瓶中，定容，摇匀，即得〔16〕。

2.2.3 色谱条件 采用高效液相色谱法〔16〕测定不同处理组滇重楼薯蓣皂苷元的含量，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（90：10），流速为 1.0 mL∕min，检测波长203 nm，柱温35℃。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取1、2、5、10、15、20、25 μL对照品溶液，按照“2.2.3”项下色谱条件测定，得出以峰面积A为纵坐标，进样量浓度C为横坐标的线性回归方程，A=649 532C+160 81（r=0.999 1）。线性范围为0.539～13.475 μg∕mL。

2.2.5 精密度、重复性、稳定性和加样回收率试验通过对薯蓣皂苷元含量测定进行方法学考察，结果精密度试验RSD为0.21%（n=6）；重复性试验RSD为2.13%（n=6）；稳定性试验RSD为1.29%（n=6）；平均加样回收率为96.52%（n=6），RSD为2.16%（n=6）。结果均符合含量测定的要求。

2.2.6 测定结果 大部分AM真菌处理组中薯蓣皂苷元含量与CK组比较差异无统计学意义（P＞0.05），其含量波动范围在（0.978 2 ±0.095 1）mg∕g（Sdi）到（8.153 0±0.774 8）mg∕g（Pb）之间。但经过Dh和Svi真菌处理后的滇重楼根茎中，薯蓣皂苷元含量均有提高。其中用Dh真菌处理过的根茎的薯蓣皂苷元含量为10.745 3 mg∕g，Svi处理组的薯蓣皂苷元含量为41.404 5 mg∕g，提高得最为明显。这两组与CK组的含量比较差异有统计学意义（P＜0.05）。可见AM真菌处理对滇重楼根茎中薯蓣皂苷元含量有影响，尤其是Svi真菌。见表1。

表1 不同AM真菌处理组的薯蓣皂苷元含量

3 讨论

本实验结果表明，不同处理组的滇重楼根茎均能与28种AM真菌形成共生关系，但不同AM真菌对滇重楼中薯蓣皂苷元含量的影响不同。接种AM真菌处理组的滇重楼菌根侵染率普遍高于CK组，部分差异有统计学意义，部分差异无统计学意义，这与周浓等〔16〕、杨光等〔17〕研究结果相一致。滇重楼的主要活性成分是甾体皂苷类化合物，包括薯蓣皂苷和偏诺皂苷等。薯蓣皂苷元是薯蓣皂苷水解得到的产物〔18-19〕，薯蓣皂苷元在制药行业应用十分广泛，是合成甾体激素类药物的重要成分，具有解毒、抗肿瘤、抗炎、降血脂、免疫调节、保护胃黏膜等作用，为滇重楼的有效成分和质量控制指标之一。本实验结果显示AM真菌的接种有助于提高滇重楼中薯蓣皂苷元的含量，效果最佳者为Svi真菌。在周浓等〔11〕的研究中显示接种Svi真菌，有助于提高侵染率，同时可提高重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ的含量，也间接反映了Svi真菌是有助于提升滇重楼入药品质的AM真菌。本研究仅针对滇重楼中一种入药品质指标进行检测，在今后的研究中还应进一步加强其他入药品质指标的研究，为合理施用生物肥料，提高入药品质奠定理论基础。