孙涛 杜凤梅

摘要 目的：动态监测肠道病毒71型（EV71）阳性重症手足口病患儿外周血Th17、CD4⁺CD25⁺Treg表达变化及其意义。方法;收治重症手足口病患儿60例作为重症组，同期选择普通组105例，健康对照组30例。监测各组CD4⁺CD25⁺Treg、Th17及细胞因子TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17的表达。结果：重症组Th17、IL-6、IL-10、IL-17的表达明显高于健康对照组（P<0.01），而CD4⁺CD25⁺Treg、TGF-β的表达明显低于健康对照组（P<0.01）。结论：重症组手足口病患儿中Th17表达升高、CD4⁺CD25⁺Treg表达降低，且与病情严重程度相关，可作为预测病情严重程度及预后评估的重要参考指标。

关键词 手足口病;Th17;CD4⁺ CD25⁺ Treg;预后评枯

手足口病的病原主要是肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇A组16型，近几年来EV71感染的病例在我国各地皇上升趋势。重症手足口病以EV71感染多见，病情凶险，并发症多，病死率高[1，2]。因此早期发现并及时治疗重症患儿，可提高抢救成功率，挽救患儿生命。

资料与方法

分层随机抽样2016年3月-2016年9月入住我院感染科的手足口病患儿165例，均符合卫生部《手足口病诊疗指南2010版》诊断标准[3]。其中男95例，女70例，年龄10个月～5岁，平均2.2岁。同期选择普通组105例，健康对照组30例。

方法：入组患儿分别于病程第1、5、10天采集EDTA静脉抗凝血各3mL，分别进行检测。①Th17、CD4⁺ CD25⁺Treg细胞的检测：对于Th17细胞标记的处理，首先分离外周血单个核细胞（PBMC），用抗凝管采集外周静脉血2mL，加入2mL的淋巴细胞分离液，1000×g离心5min，离心后管内容物分为4层，从上往下依次为血浆层、白膜层、淋巴细胞分离液层、红细胞层。用毛细吸管吸出白膜层中的单个核细胞置于清洁离心管内，加入4～5mL PBS洗涤2次，弃上清即得所需细胞。加入CD3-APC、CD8-PE-Cy7流式抗体各5μL，混匀，4℃避光孵育30min。加入1mL PBS洗涤2次，447×g离心5min弃上清。加入100μL破膜/洗涤缓冲液（蒸馏水1：10比例稀释原液）进行细胞打孔利于细胞因子染色，室温避光5min，加入1mL PBS洗涤，447×g离心5min弃上清，此步骤重复1次，加入100μL破膜/洗涤缓冲液并立即加入5μL PE标记的鼠抗人IL-17抗体，室温避光20min，加1mL PBS静置30min，期间每隔10min在斡旋震荡仪上混匀1次，使抗体与细胞内受体充分结合，447×g离心5min弃上清，重悬细胞于300～400μL PBS中，充分混匀后上流式细胞仪进行检测。②血清细胞因子检测：采用双抗体夹心ELISA法检测患儿血清TCF-β、IL-6、IL-10和IL-17的含量，检测试剂盒购自青岛腾辉医学科技有限公司，按说明书进行操作。

统计学处理：使用SPSS19.0统计软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，采用方差分析，各组不同时间点间计量资料的比较采用重复测量的方差分析，同一时期各组与健康对照组比较采用Dunnett-t检验，各组内不同时间点的两两比较采用配对t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

各组外周血TGF-β、IL-6、IL-10和IL-17的表达比较：病程第1天普通组、重症组中TGF-β的表达均低于健康对照组，且随病情的加重呈下降趋势。IL-6、IL-10和IL-17的表达均高于健康对照组，且随病情的加重呈上升趋势。上述各血清细胞因子组间比较差异均有统计学意义。

各组患者Th17、CD4⁺ CD25⁺Treg细胞表达的动态观察结果比较：病程第1d普通组、重症组Th17的表达均高于健康对照组，随病情的加重呈上升趋势。普通组、重症组CD4⁺ CD25⁺ Treg的表达均低于健康对照组，随病情的加重呈下降趋势。各组间免疫指标比较差异均有统计学意义。

重症组存活与死亡患儿Th17、CD4⁺CD25⁺ Treg细胞表达的动态观察结果比较：对各组Th17、CD4⁺ CD25⁺ Treg的表达进行动态观察发现，在观察期间存活组Th17的表达水平明显低于死亡组，差异有统计学意义（P<0.05），CD4⁺CD25⁺Treg的表达在病程第1天差异无统计学意义（P>0.05），随着病情的进展，第5、10天差异有统计学意义（P<0.05）。

重症组存活与死亡患者Th17、CD4⁺CD25⁺ Treg细胞表达测定：其中Th17细胞标记为CD3⁺ CD8^-IL-17⁺，从淋巴细胞中选取T细胞，以CD3⁺ CD8^-确定CD4⁺ T细胞。

讨论

手足口病是由多种肠道病毒引起的儿童常见传染病，人群对其普遍易感，且感染后临床表现轻重不一，轻者仅表现为自限性手足口病或疱疹性咽峡炎，重者可出现脑干脑炎、神经源性肺水肿或肺出血，甚至心肺衰竭[4，5]。

本研究发现手足口病组随病情进展Th17的表达水平逐步增高，IL-17有着相同的表达趋势，CD4⁺ CD25⁺ Treg表达水平逐步下降。CD4⁺ CD25⁺ Treg细胞/Th17细胞平衡失调的机制不明确。EV71感染导致CD4⁺ CD25⁺ Treg细胞/Th17细胞平衡失调，考虑可能为EV71感染患儿随着病情的加重外周血淋巴细胞绝对数下降，CD4⁺ T细胞也随之下降，CD4⁺CD25⁺ Treg比例的降低可能与其有关。

综上所述，手足口病患儿体内存在免疫功能紊乱，CD4⁺ CD25⁺ Treg细胞/Th17细胞表达的失衡能反应手足口病，尤其是重症患儿机体免疫抑制状况。重症手足口病患儿Th17，CD4⁺ CD25⁺ Treg的表達水平可作为预测病情严重程度及评估预后的一项敏感而有效的指标，为临床治疗中适时给予免疫调节治疗提供理论依据。Th17、CD4⁺ CD25⁺ Treg检测具有简单、快捷、准确等特点，值得临床推广。

参考文献

[1]唐红平，汪秋珍，李德辉，等.重症手足口病42例临床分析[J].新医学，2008，39（2）：718-720.

[2]田健美，李健琴，孔小行，等.144例手足口病患儿细胞和体液免疫变化及意义[J].临床儿科杂志，2011，29（2）：1156-1158.

[3]手足口病诊疗指南2010年版[S].卫生部，2010.

[4]李双杰.肠道病毒71型感染性疾病[J].实用儿科临床杂志，2008，23（2）：1780-1782.

[5]朱汝南，钱渊，邓洁，等.北京市儿童手足口病与肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型感染有关[J].中华流行病学杂志，2007，28（3）：1004-1008.