门 涛

精神分裂症是临床常见的受基因变异和环境影响的疾病，严重影响患者的身心健康，主要采用药物治疗。利培酮是第二代抗精神病药物，其主要特点是对精神分裂症患者的阴性或阳性症状均有较好的临床疗效，并且与传统的抗精神病药物相比，其引起锥体束外反应的危险性较小[1]。利培酮的药物动力学研究显示，其体内暴露剂量存在个体差异性，而单核苷酸突变可能是其个体差异的主要原因[2]。既往研究表明，CYP2D6和CYP3A5是利培酮体内代谢的关键限速酶，因单核苷酸突变而出现的不同基因型携带者的利培酮浓度具有明显差异[3-4]。国外已有报道CYP2D6*4、*6等基因型对于利培酮药物代谢的影响，而在亚洲，CYP2D6*10和CYP3A5*3作为主要等位基因突变类型[5]，在与利培酮的临床疗效研究中较为少见。因此，本研究观察CYP2D6和CYP3A5基因多态性联合检测对精神分裂症患者服用利培酮药物浓度的影响，旨在寻找能够预测个体化服用利培酮药物疗效的生物学指标。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2017年5月至2018年5月在营口市第四人民医院精神科接受诊治的精神分裂症患者为研究对象，病例纳入标准：①符合美国《精神障碍诊断与统计》第 5版中精神分裂症的诊断标准[6]；②治疗期间未服用其他抗精神病药物，仅服用利培酮治疗且超过1周；③肝、肾功能无明显异常。排除标准：①有培酮药物过敏和耐药史；②妊娠期女性；③有药物滥用史或吸毒史。最终纳入83例患者，其中男41例，女42例，年龄23～58岁，平均（35±11）岁；平均体重指数（24±4）kg/m2。利培酮服药方法为早晚各1次，每次2～5 mg。

1.2CYP2D6和CYP3A5基因多态性检测每例患者服药 1个月，血药浓度达到稳态后，于清晨空腹采集静脉全血2 ml，EDTA-Na抗凝，采用传统的酚-氯仿抽提法提取全血样本中的DNA，采用紫外分光光度法测定OD260和OD280值，保证其DNA纯度为1.6～2.0。CYP2D6和CYP3A5基因多态性检测相关试剂和引物设计由上海吉凯基因公司提供，CYP2D6引物序列：上游5，-GATGAAGGGATAAT GTGGTCC-3，下游5，-GGTCCAAACAGGGAAGA AATA-3，；CYP3A5引物序列：上游 5，-CTGTGG TAGCCACCCACCATCCAT-3，下游5，-TCAACAA CGCACGTTCACTCACAGCA-3。PCR反应体系共25 μl，分别为 PCR 反应液（10×）2.5 μl、Mg2+（100 mmol/L）1.5 μl、dNTP（20 mmol/L）0.5 μl、Taq 酶（5 U/μl）0.2 μl、Primer（5 pmol/L）0.4 μl、上下游引物各 1 μl、DNA 模版 1 μl、ddH2O 16.9 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性10 min，共35个循环，94 ℃变性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，最后72 ℃延伸8 min，4 ℃下保存1周。CYP3A5 PCR产物行酶切反应，体系为305 μl，分别为限制性内切酶 Sspl（5 U/μl）1 μl、Buffer 2 μl、PCR 产物 10 μl、ddH2O 17 μl。混匀后37 ℃孵育5 h，后取酶内切产物以及CYP2D6 PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，以检测其基因多态性。CYP3A5 *1/*1基因多态性表现为148 bp、125 bp与 20 bp，*3/*3基为 168 bp和 125 bp，*1/*3为168 bp、148 bp、125 bp和20 bp。CYP2D6*1/*1基因多态性表现为433 bp和180 bp，*10/*10型为433 bp和290 bp，*1/*10型为433 bp、290 bp和180 bp。

1.3血浆利培酮与9-羟基利培酮测定采用液相色谱法进行检查。取EDTA-Na抗凝全血血浆300 μl，加入15 μl内标液，混匀后再加入提取液1 ml，1500 r/min，离心5 min，吸取上层有机相，转移至洁净聚丙烯塑料管，于38 ℃下烘干，然后用100 μl 50%甲醇水溶液溶解，混匀后离心5 min（1500 r/min），最后取10 μl放入自动进样管待测。质谱条件：电喷雾离子源、MRM扫描、Capcell PAK C18MG分析柱、含0.02%甲酸水溶液的流动相A、含0.02%甲酸乙腈溶液的流动相B、电压1500 V、温度450 ℃、梯度洗脱，流速为0.4 ml/min。

1.4统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料以±s表示，非参数检验比较采用 Mann-Whitney检验和 Kruskal-Wallis检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CYP2D6基因多态性和血浆利培酮与9-羟基利培酮的相关性分析血浆利培酮、9-羟基利培酮与总活性产物（利培酮+9-羟基利培酮）在CYP2D6*10/*10基因型中浓度均明显高于*1/*1和*1/*10，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而在CYP2D6 *1/*1和*1/*10基因型中差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。Spearman相关分析显示，血浆利培酮、9-羟基利培酮、总活性产物和CYP2D6 *10/*10呈明显正相关（r=0.756、0.773、0.812，P＜0.001）。

表1 CYP2D6基因多态性和血浆利培酮与9-羟基利培酮的相关性(ng/ml,±s)

表1 CYP2D6基因多态性和血浆利培酮与9-羟基利培酮的相关性(ng/ml,±s)

注：与*1/*1和*1/*10组比较，aP＜0.05

基因多态性 例数 利培酮 9-羟基利培酮 总活性物*1/*1 21 52±12 58±13 108±15*1/*10 36 79±16 80±17 159±32*10/*10 26 243±36a 290±35a 532±68a

2.2CYP3A5基因多态性和血浆利培酮与9-羟基利培酮的相关性分析血浆利培酮与总活性产物浓度在CYP3A5 3种基因型中差异无统计学意义（P＞0.05），而9-羟基利培酮浓度差异有统计学意义（P＜0.05），并且CYP3A5 *3/*3基因型中9-羟基利培酮浓度明显高于*1/*1与*1/*3，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。Spearman相关分析显示，血浆9-羟基利培酮与CYP3A5 *3/*3呈明显正相关（r=0.743，P＜0.05）。

2.3CYP2D6与CYP3A5联合检测CYP2D6*10/*10和CYP3A5*3/*3联合检测，与其单一纯合子进行比较发现，血浆利培酮、9-羟基利培酮与总活性产物在*3/*3且*10/*10基因组中均明显高于单一*3/*3或*10/*10，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表2 CYP3A5基因多态性和血浆利培酮与9-羟基利培酮的相关性研究(ng/ml,±s)

表2 CYP3A5基因多态性和血浆利培酮与9-羟基利培酮的相关性研究(ng/ml,±s)

注：与*1/*1和*1/*3组比较，aP＜0.05

基因多态性 例数 利培酮 9-羟基利培酮 总活性物*1/*1 25 89±15 218±31 306±35*1/*3 30 96±18 235±35 330±32*3/*3 28 123±22 317±42a 439±64 F值 265.5 235.5 270.0 P值 0.144 0.032 0.118

表3 CYP2D6与CYP3A5联合检测与血浆利培酮与9-羟基利培酮的相关性研究(ng/ml,±s)

表3 CYP2D6与CYP3A5联合检测与血浆利培酮与9-羟基利培酮的相关性研究(ng/ml,±s)

联合检查 例数 利培酮 9-羟基利培酮 总活性物*3/*3 且*10/*10 20 236±26 294±31 529±58*3/*3 或*10/*10 14 146±17 204±21 349±37 U值 112.5 121.0 105.5 P值 0.014 0.018 0.007

3 讨论

精神分裂症是一种体内基因变异和生活环境共同作用下发生的一类具有遗传倾向的疾病，流行病学研究显示我国精神分裂症的发病率约为 1%[7]，大多数患者预后不佳，给家庭和社会造成重大负担。精神分裂症目前主要采用口服药物治疗，利培酮是一种苯并异恶唑衍生物，也是一种新型的非传统的抗精神病药物，临床上主要用于治疗各种急、慢性精神分裂症及精神病状态下的相关临床症状[8]，其主要活性成分是 9-羟利培酮，它是一种选择性的单胺能拮抗剂，可在机体内与 5-羟色胺能的 5-HT2受体和多巴胺能的D2受体结合，通过拮抗其生物学效益，可以有效缓解锥体外系副作用的发生，并且对精神分裂症的阴性症状和情感障碍也有较好的改善作用[9]。同时，9-羟利培酮与多巴胺能受体的相互结合，可以明显改善精神分裂症的阳性症状，并且对运动功能的抑制作用及其相关强制性晕厥的发生率均低于传统的抗精神病药物[10]。

研究发现，个体化药物治疗对环境的敏感性存在明显的差异性，并且这种差异性取决于机体的不同基因型[11-12]。因此，目前临床药理研究中，不同患者服用利培酮可表现出不同的临床疗效和不良反应，这些表现均受基因多态性的影响，研究和证实相关基因多态性对于利培酮临床疗效的影响和对患者安全用药有极大的帮助[13]。CYP450酶系的诸多酶类分布于多种器官、组织上，参与多种生命活动，包括固醇类物质合成、脂肪酸和激素的氧化分解、大多数药物或外来物的生物氧化等，通过代谢解毒和代谢活化的作用参与机体的新陈代谢。CYP450基因的突变和多态性可以导致相应酶的活性降低、升高、甚至是失活，酶活性的改变可能会导致个体服药疗效的差异[14]。

既往研究发现，CYP2D6和CYP3A5是重要的CYP450酶系成员，同时发现CYP2D6是利培酮体内代谢的主要限速酶[15]，其等位基因突变在亚洲人群主要以CYP2D6 *10基因型为主，是外显子1第188位置碱基C变成T导致，从而会使蛋白表达的脯氨酸变成丝氨酸，导致其表达酶的活性降低，底物药物的代谢活性也会相应减弱[16]。本研究显示，CYP2D6 *10/*10基因型中血浆利培酮、9-羟基利培酮与总活性产物浓度明显高于*1/*1和*1/*10，提示CYP2D6突变型纯合子*10/*10携带者的利培酮与9-羟基利培酮药物代谢较慢，其体内药物浓度明显高于突变型杂合子*1/*10和野生型纯合子*1/*1，指导临床医师对于CYP2D6*10纯合子携带者更加注意利培酮的用药剂量，因为药物代谢慢，患者不良反应的发生率也较大。另外，CYP3A也参与了利培酮体内代谢过程，特别是CYP3A5与 9-羟基利培酮代谢密切相关[17]。CYP3A5*3是由外显子3的第6986碱基A变成G所致，会使9-羟基利培酮代谢活性减弱，本研究结果证实，CYP3A5*3突变纯合子的9-羟基利培酮浓度明显高于*1/*1和*1/*3。进一步分析CYP2D6和CYP3A5突变纯合子联合检查的重要性，与单一突变纯合子患者比较，血浆利培酮、9-羟基利培酮与总活性产物在*3/*3且*10/*10基因组中明显增高，表明CYP2D6*10和CYP3A5*3纯合子人群血浆利培酮代谢更加缓慢，临床工作者要及时调整用药剂量，在发挥药物疗效的同时，更要防止药物不良反应的发生。