刘晶英　张鼎

摘要：为研究镉对肉鸡肝脏、肾脏的病理学损伤及锌和N-乙酰半胱氨酸（NAC）分别对镉中毒肉鸡肝、肾病理学损伤的拮抗作用，对AA肉鸡肌肉注射Cd2+（1 mg/kg BW和5 mg/kg BW）建立梯度镉中毒模型，同时采用肌肉注射的方式向镉中毒肉鸡补充Zn2+（5 mg/kg BW）或NAC（50 mg/kg BW）。结果表明，镉中毒10 d和20 d后，肉鸡肝脏、肾脏呈现严重的病理学损伤，补充Zn2+或NAC后镉中毒肉鸡肝脏充血现象减轻，肝细胞坏死数减少，肝细胞空泡结构、颗粒性变性现象减轻，肝脏内炎性细胞浸润量显著减少。肾脏出血减轻，肾小管管腔形态好转，肾细胞空泡结构、颗粒变性减轻，肾细胞排列紧密，细胞间间隙减小，肾细胞核消失和肾脏炎性细胞量显著减少。说明镉中毒可以造成肉鸡肝脏和肾脏严重的病理学损伤，Zn2+或NAC补充能有效抑制镉中毒引起的肉鸡肝、肾病理学损伤。

关键词：镉；锌；NAC；肉鸡；肝脏；肾脏；病理学损伤

中图分类号：R994.6 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2018）09-0005-04

镉是一种有毒的重金属元素，因其良好的柔韧性和抗氧化性，被广泛应用于工业生产中。镉可以引起人和动物肝、肾等多種器官的毒性损伤，同时造成呼吸、消化、神经、生殖和免疫等各类系统的功能破坏[1，2]。我国是世界上最大的镉开发和利用国，近年来随着镉在工业生产中的不断利用，环境镉污染变得越来越严重。小麦、大米和玉米等农作物对土壤中的镉离子具有很强的吸收能力，导致镉离子在植物叶子、果实和根茎中的不断积累[3]。动物通过长期采食被镉污染的植物或饲料，造成镉离子在机体内的持续积累，最终引起镉中毒。

锌是一种机体必需的微量元素，参与机体120多种酶的生物合成和300多种酶的功能调控。缺锌会造成胎儿发育异常、免疫力下降、神经紊乱、机体疾病发生和死亡率提高等一系列后果。近年来，人们发现锌可以对抗包括重金属在内多种刺激引起的细胞毒性，起到解毒作用[4]。本研究前期研究结果表明，适量浓度的锌补充可以有效对抗镉引起的细胞毒性，减少镉诱导的细胞ROS产生，降低细胞氧化损伤程度[5]。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种含硫氨基酸衍生物，含有丰富的巯基活性基团。NAC能够消除机体和细胞产生的自由基，提高机体的抗氧化能力。有文献报道，NAC可以抑制镉中毒造成的毒性损伤，缓解镉中毒导致的氧化损伤，起到保护细胞的作用[6]。

我国是肉鸡养殖大国，鸡肉中镉含量的超标将直接给人的健康和生命带来巨大的威胁。研究镉对肉鸡的毒性损伤，一方面有助于及时诊断肉鸡镉中毒，减少镉在人食物链中的传播；另一方面也能为人镉中毒的诊断提供依据。本试验通过建立肉鸡镉中毒模型，研究镉对肉鸡肝、肾的病理学损伤，并通过补充Zn2+和NAC的方式研究Zn2+和NAC对镉中毒病理学损伤的拮抗作用，为镉中毒研究提供参考依据，同时也为镉中毒的预防和治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验动物

1日龄AA肉鸡90羽，购自山西大象农牧集团有限公司。

1.2 动物处理

1日龄AA肉雏鸡预饲养1周后，随机分为9个组（表1），每组10羽。超纯水分别溶解CdCl2、Zn（C6H11O7）2和N-乙酰半胱氨酸（NAC），制备储存液。分别对肉鸡每天腿部肌肉注射1、5 mg/kg体重 （BW）Cd2+建立浓度梯度性镉中毒，通过向镉中毒肉鸡每天肌肉注射Zn2+（5 mg/kg BW）或NAC（50 mg/kg BW）的方式建立Zn2+和NAC补充模型。分别在试验第10天和20天每组扑杀5羽肉鸡，将肝脏、肾脏于10%中性甲醛溶液中固定，进行病理组织学观察。

1.3 苏木素-伊红染色

将肝、肾组织梯度乙醇脱水、透明后进行常规石蜡包埋、切片，厚度为5 μm。二甲苯透明，梯度乙醇脱水后用苏木素-伊红（HE）染色试剂盒对切片进行染色，其中苏木素染液染色10 min，伊红染液中染色30 s，自来水充分冲洗后封片，光学显微镜下镜检。

1.4 肝、肾病理学损伤计数分析

试验对中毒20 d后各组扑杀的5羽肉鸡肝、肾HE染色结果进行观察。每羽肉鸡的肝脏或肾脏切片采用双盲法随机选择3幅视野（200×），对肝、肾切片中坏死细胞数、空泡细胞数、颗粒变性细胞数、核崩解/消失细胞数、炎性细胞数、出血点数等进行统计，以定量分析Zn2+或NAC对镉中毒肉鸡肝、肾病理学损伤的拮抗作用。

1.5 数据分析

采用软件SPSS 20.0分析统计数据，结果用平均数±标准差（Mean±SD）的方式表示，采用单因素方差分析法（Duncans test）对组间差异性进行分析，P<0.05表示差异性显著。

2 结果与分析

2.1 镉对肉鸡肝、肾组织的病理学损伤

正常鸡肝细胞结构完整，核仁清晰，肝细胞排列紧密，肝细胞与肝血窦以中央静脉为中心向周围呈放射状排列（见图1A）；肾脏细胞排列紧密，大小均一，核仁清晰，肾脏无充血、出血现象（见图2A）。1 mg/kg BW Cd2+中毒10 d后，肝脏出现充血现象，细胞轮廓模糊，肝细胞发生颗粒变性，胞浆内出现空泡结构，部分肝细胞核崩解、消失（见图1A-1）。中毒20 d后，与对照组相比，肝脏的损伤加重，出血现象较明显，肝细胞坏死数显著增多（P<0.05），颗粒变性加剧（P<0.05），肝细胞空泡结构明显（P<0.05）、细胞核崩解严重（P<0.05），肝脏炎性细胞浸润量增多（P<0.05）（图1C-1；图5A）。1 mg/kg BW Cd2+r中毒10 d后，肾脏有充血现象，肾小管管腔形态不完整，少量上皮细胞溶解、脱落，部分细胞空泡变性，可见少量炎性细胞（图2A-1）。中毒20 d后，肾脏的损伤加重，与对照组相比，肾脏出血严重（P<0.05），肾小管管腔形态紊乱，上皮细胞溶解、脱落数增加，肾细胞空泡结构、颗粒变性程度加剧（P<0.05），细胞核消失现象严重（P<0.05），肾脏伴有显著的炎性细胞浸润（P<0.05）（图2C-1；图5B）。相对于轻度镉中毒，重度镉（5 mg/kg BW Cd2+）中毒10 d和20 d后肉鸡肝、肾病理学损伤进一步加剧，表现为肝脏出血严重，肝细胞坏死增加、空泡变性严重，肝组织出现大量的炎性细胞浸润，肝血窦的走向混乱，大量的细胞核崩解消失（图1A-2，C-2）。肾脏结构损伤加剧，肾间质内出血、充血现象严重，充满大量红细胞，细胞核崩解、消失，肾小管管腔形态不完整，肾小管上皮细胞脱落，可见炎性细胞浸润，管腔渗出物增多（图2A-2，C-2）。

2.2 Zn2+对镉中毒鸡肝脏、肾脏的保护作用

向肉鸡单独补充Zn2+未对肉鸡肝脏（图1B，图1D）、肾脏（图2B，图2D）结构产生影响。分别对轻度镉中毒（1 mg/kg BW Cd2+）和重度镉中毒（5 mg/kg BW Cd2+）肉鸡补充5 mg/kg BW Zn2+，结果显示，相对于镉中毒组，补充Zn2+能有效缓解镉中毒引起的鸡肝脏、肾脏病理学损伤。具体表现在添加Zn2+后镉中毒肉鸡肝脏充血症状改善，肝细胞坏死数减少（P<0.05），细胞核仁完整，界限清晰，肝细胞核崩解量降低（P<0.05），细胞空泡变性、颗粒变性减轻（P<0.05），肝血窦的走向相对清晰，炎性细胞浸润减少（P<0.05）（图1B-1，B-2，D-1，D-2，图5A）。肾脏出血现象减轻（P<0.05），肾细胞界限清晰，细胞核完整，核消失现象减少（P<0.05），肾小管管腔形态完整，肾上皮细胞脱落减少，细胞颗粒变性、空泡现象减轻（P<0.05），炎性细胞量减少（P<0.05）（图2B-1，B-2，D-1，D-2；图5B）。

2.3 NAC对镉中毒肉鸡肝脏、肾脏的保护作用

向肉鸡单独补充NAC后肉鸡肝脏（图3B，图3D）、肾脏（图4B；图4D）结构正常，未引起病理性损伤。对镉中毒（1 mg/kg BW 或5 mg/kg BW Cd2+）肉鸡补充NAC后，病鸡肝脏充血现象减轻，肝组织空泡样结构减少（P<0.05），肝细胞颗粒性变性程度降低（P<0.05）、肝细胞核核崩解量减少（P<0.05），炎性细胞浸润现象得到改善（P<0.05），肝血窦结构较清晰（图3B-1，B-2，D-1；D-2；图5A）。肾脏充血、出血现象减轻（P<0.05），肾小管管腔形态好转，内有少量浸出物，肾小管上皮细胞轻微脱落、溶解，肾细胞颗粒变性现象减少（P<0.05），细胞间间隙减小，核消失细胞数减少（P<0.05），炎性细胞浸润减轻（P<0.05）（图4B-1，B-2，D-1，D-2；图5B）。

3 小结与讨论

本试验研究结果表明镉可以造成肉鸡肝脏和肾脏浓度-时间依赖性病理学损伤，这与课题组前期在小鼠体内镉中毒试验结果相一致[7]。镉对机体的毒性损伤机理涉及多个方面，首先，镉可以引起细胞严重的氧化损伤。活性氧类（ROS）是引起细胞氧化损伤的重要源头，Cd2+可以造成ROS在细胞内短暂或持续性地增加。线粒体是ROS产生最主要的场所，Cd2+通过破坏线粒体电子呼吸传递链的正常进行，抑制细胞呼吸，造成ROS在细胞内的大量聚集[8]。镉还可以通过间接途径诱导ROS产生，将Fe2+、Cu2+等Fenton金属元素从与它们结合的胞质或胞膜蛋白上置换下来，造成胞质内Fe2+和Cu2+含量上升，进而引起细胞ROS产生增加，发生氧化损伤[9]。除了诱导ROS产生，Cd2+还通过消耗细胞内抗氧化蛋白引起细胞氧化损伤。金属硫蛋白（MT）是细胞内重要的抗氧化蛋白，在镉中毒解毒过程中起到关键的作用。MT通过与Cd2+结合，能将有毒的游离态Cd2+转化为没有毒性的MT-Cd。结合Cd2+后的MT丧失还原性，失去对ROS的清除能力，最终造成ROS在细胞内的过量聚集[10，11]。

研究表明Zn2+可以有效拮抗镉产生的组织或细胞毒性。Zn2+通过促进细胞内还原性蛋白和抗氧化酶的表达，提高细胞的抗氧化能力，加速细胞对ROS的清除速率，对抗刺激源引起的细胞脂质过氧化物反应和氧化性损伤。研究表明适量浓度的锌补充可以有效对抗镉引起的细胞毒性，减少镉诱导的细胞ROS产生，降低细胞氧化损伤程度[12]。Zn2+是MT生理状态下结合的主要金属离子，同时也是MT细胞表达的重要诱导物。镉中毒能引起细胞中MT基因、蛋白表达水平一定程度的上升，向镉中毒细胞中添加Zn2+，MT基因、蛋白表达量进一步显著上升，表明Zn2+能通过增强MT的表达水平，增强细胞对ROS的清除能力，进而抑制镉毒性。MT基因的转录依赖于具有活性功能的金属反应转录因子（MTF-1）的调控。MTF-1是分子质量为53 kD的核转录蛋白，在各种哺乳动物和昆虫中普遍表达且具有高度的保守性。Zn2+是MTF-1蛋白发挥功能的必需辅基，Zn2+通过与MTF-1结合，使MTF-1蛋白从非DNA结合型的无活性状态转变为DNA结合型的活性状态。DNA结合型MTF-1蛋白作为正调控因子向细胞核移动，与位于MT基因启动子上游的金属效应元件（MRE）结合并激活其活性，开启MT基因的转录程序[13]。

NAC是一种重要的抗氧化物质，可以对内源性或外源性氧化损伤起到抑制作用。近年来有研究表明NAC可以有效缓解镉中毒产生的氧化损伤。NAC的抗氧化作用主要通过两种机制实现。一是NAC进入细胞后可以脱去乙酰基转变为半胱氨酸，而半胱氨酸是还原性谷胱甘肽（GSH）合成的前体。NAC通过促进GSH合成，间接提高细胞的抗氧化能力，对抗镉中毒[14]。同时NAC能增加过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，阻止丙二醛（MDA）的生成量增加，抑制ROS生成。二是NAC自身含有丰富的巯基基团，可以与Cd2+结合，降低细胞有毒Cd2+含量[15]。另外NAC自身的巯基基团可以直接消除羟自由基、H2O2及ROS等氧化性物质，阻止超氧阴离子产生，达到维持细胞氧化还原平衡状态的目的[16]。

综合全文，本研究证明了镉中毒可以引起肉雞肝脏、肾脏严重的病理学损伤。对肉鸡补充Zn2+或NAC均能有效缓解镉中毒引起的肉鸡肝脏、肾脏病理学损伤。Zn2+和NAC对镉中毒肉鸡肝、肾的保护作用可能是通过不同机制实现的，这为下一步研究Zn2+和NAC联合使用对镉中毒的拮抗作用提供了有效依据，同时也为人重金属中毒的防治提供了参考。

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