周慧敏，张顺亮，赵 冰，李 素，潘晓倩，任 双，曲 超，成晓瑜*

（中国肉类食品综合研究中心，国家肉类加工工程技术研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068）

腊肉是以鲜（冻）畜肉为主要原料，配以其他辅料，经腌制、烘干（风干）、烟熏（或不烟熏）等工艺加工而成的非即食肉制品[1]，从广义上讲也属于低酸发酵肉制品（pH≥5.5）。虽具有风味浓郁、可常温贮藏、食用方便等特点，深受广大消费者的青睐，但仍面临一些问题，一方面工艺落后，生产周期长，成本高；另一方面采用自然发酵，易受到杂菌污染，导致产品质量不稳定和不可控[2]。因此腊肉实现工业化生产已成为大势所趋。企业虽然采用快速腌制和高温烘烤加工工艺，大幅缩短了生产周期（3～4 d）、减少了库存量并提高了产品的卫生状况，但因风干成熟期短且采用高温烘干工艺，既加速了脂肪氧化，又缺失了微生物发酵对产品风味的贡献，导致产品的风味与传统工艺生产的腊肉相比，仍存在一定的缺陷[3-7]。因此解决工业化产品风味方面的问题是现代工业化腊肉制品生产的关键。

自从国外将发酵剂应用于肉制品中，西式发酵肉制品成功崛起，吸引了众多研究者分离筛选出适宜生产肉制品的发酵剂菌株[8]，并进一步深入研究发酵菌株改善产品品质[9-12]及产生风味物质机理[13-14]方面的相关研究。目前开发的肉用商业发酵剂有清酒乳杆菌属、肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌属、青霉及汉逊氏德巴利酵母菌等[10,13-14]。葡萄球菌具有护色增香的功效，通过产硝酸还原酶和过氧化氢酶等促进发色，且其代谢产物通过分解蛋白质和脂肪释放出更多的香气物质，在发酵肉制品的风味形成中起重要作用[15-16]，一直是国内外研究的热点。

国内目前关于葡萄球菌的筛选及在发酵香肠中的应用研究较多，如潘晓倩等[17]研究发现葡萄球菌商业发酵剂对北方风干香肠色泽和风味具有改良作用；孙为正等[18]发现葡萄球菌和巨球菌可以显著降低广式腊肠产品中的亚硝酸盐残留量。于海等[19]发现葡萄球菌YD25对发酵香肠中挥发性风味物质的含量影响显著，且其含量比例因不同工艺条件而发生相应的变化。而关于葡萄球菌发酵剂对腊肉品质的影响相关的研究并不多，甚至利用葡萄球菌发酵剂优化工业化生产腊肉的品质相关研究鲜见报道，由于不同产品之间工艺存在差异，且腊肉为低酸发酵肉制品。基于前期针对几种商业发酵剂的种类及其添加量对腊肉产品感官品质的影响，优选出不产酸耐盐耐高温的木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌混合发酵剂T-SC-200。

因此，本实验以不添加发酵剂的腊肉为空白对照，对比分析产品的理化指标、微生物特性，应用气相色谱-质谱-嗅闻仪联用分析香气活性化合物组成，同时进行感官评价和电子鼻分析，研究木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌混合发酵剂T-SC-200对产品品质的影响，以期为该技术的产业化提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原辅料：带皮猪后腿肉 北京鹏程食品有限公司；加工用辅料 中国肉类食品综合研究中心香辛料部；木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌混合发酵剂T-SC-200（活菌量0.95×1010CFU/g） 科汉森（北京）贸易有限公司；混合发酵剂的相关资料见表1。

表1 T-SC-200混合发酵剂的生理学资料Table 1 Physiological properties of starter culture mixture T-SC-200

培养基：MRS培养基、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂、甘露醇氯化钠琼脂（mannitol and sodium chloride agar，MSA）培养基、平板计数琼脂 北京陆桥技术有限责任公司；含溴甲酚紫的MRS培养基：1 L MRS培养基中添加1.4 mL 1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液。

2-甲基-3-庚酮、C8～C20系列正构烷烃 美国Sigma-Aldrich公司；正己烷（色谱纯） 德国默克公司；冰醋酸、三氯甲烷、无水乙醇、乙醚、无水硫酸钠、可溶性淀粉、氢氧化钾标准液 北京化工厂；硫代巴比妥酸、乙二胺四乙酸二钠、1,1,3,3-四乙氧基丙烷 国药集团化学试剂有限公司；碘化钾 西陇化工股份有限公司；三氯乙酸 天津市福晨化学试剂厂；硫代硫酸钠标准液天津市津科精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

DZ-600/2S型真空包装机 山东小康机械有限公司；HWS-150型恒温恒湿箱 上海森信实验仪器有限公司；CR-400色差计 柯尼卡美能达（中国）投资有限公司；烟熏炉 嘉兴艾博实业有限公司；PEN3型便携式电子鼻传感器 德国Airsense公司；TG-Wax MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、TRACE 1310型气相色谱-TSQ 8000型质谱仪 美国Thermo公司；sniffer 9000嗅闻器 瑞士Brechbühler公司；Tenax TA石英玻璃吸附管、Gerstel TDS半自动热脱附进样器、TC-200型Tenax-TA吸附管自动净化仪 德国Gerstel公司；SCIENTZ-11 L型无菌均质器 宁波新芝生物科技股份有限公司；水分活度仪 瑞士Novasina公司。

1.3 方法

1.3.1 腊肉的加工[5-7]

带皮鲜后臀肉修整成规则的形状（长15～20 cm，宽5～7 cm，厚3～4 cm）。辅料（按肉质量计，质量分数）：食盐2.2%、白砂糖0.5%、葡萄糖0.5%、二锅头白酒0.6%、味精0.15%、异抗坏血酸钠0.1%、NaNO20.002%、水5%。

原料→修整→紫外照射（20 min）→将腌制液和发酵剂菌粉混匀注射接种在肉中（T-SC-200发酵剂终接种量2×105CFU/g）→真空滚揉腌制（4 ℃，滚揉15 min+休息45 min，共24 h）→发酵（30 ℃，70%相对湿度，24 h）→一次烘干（40 ℃，60%相对湿度，2 d）→二次烘干（45 ℃，40%相对湿度，1 d）→包装即得成品，共重复做3 批次

1.3.2 常规理化指标测定

pH值测定：根据GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》[21]的方法；水分含量测定：根据GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[22]的直接干燥法；水分活度测定：采用水分活度仪。

1.3.3 色泽测定

使用色彩色差计进行测定，记录亮度值（L*）、红度值（a*）及黄度值（b*），每组样品取6 个不同的切面，每个切面取3 点，取平均值[17]。

1.3.4 感官评价

腊肉成品真空包装后于室温（25 ℃）贮藏1 周平衡水分，再进行感官分析。参照GB/T 22210—2008《肉与肉制品感官评定规范》[23]制定感官评分标准，对添加发酵剂和空白组的腊肉样品进行感官评价，由10 名受培训人员组成的感官评定小组，将腊肉切成2 mm左右的薄片蒸煮15 min，通过盲评计分，评分指标包括色泽、香气、口感及整体接受度4 方面，计分采用10 分制，评分标准见表2。

表2 感官评价标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of dry-cured meat

1.3.5 脂肪分解氧化指标测定

酸价的测定：称取100 g绞碎试样于500 mL具塞三角瓶中，加1～2 倍乙醚（30～60 ℃沸程）振荡60 min后，放置过夜，过滤后减压蒸馏得到的油脂，参考GB 5009.229—2016《食品中酸价的测定》[24]冷溶剂法测定。

过氧化值的测定：样品处理同酸价的方法，得到的油脂参考GB 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》[25]中的滴定法测定。

丙二醛含量的测定：参考GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的测定》[26]的分光光度法测定。

1.3.6 蛋白质降解指数测定

总氮含量测定：按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》[27]检测粗蛋白的含量，表示为总氮含量。

非蛋白氮含量的测定：取20 g腊肉瘦肉加25 mL 5%三氯乙酸溶液，用研磨机研磨3 min，用100 mL 5%三氯乙酸溶液洗涤研磨杯并将匀浆转移到250 mL烧杯中，静置30 min，期间搅拌4～5 次。然后用无氮滤纸进行抽滤，并用少量（50 mL）5%三氯乙酸溶液洗涤沉淀，收集滤液定容到250 mL，最后采用凯氏定氮法测定[28]。

蛋白质降解指数按公式（1）计算：

式中：NPN为非蛋白氮质量分数/%；TN为总氮质量分数/%。

1.3.7 微生物的测定

菌落总数的测定：参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》计数[29]；乳酸菌总数的测定：参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》[30]，依据菌落特征筛选菌体边缘变黄进行计数；葡萄球菌总数的测定：用MSA培养基，（36±1）℃培养（48±2）h，依据菌落特征筛选菌体周围有透明圈且培养基颜色变为黄色进行计数[17]；大肠杆菌总数的测定：参照GB 4789.41—2016《食品微生物学检验 肠杆菌科检验》[31]平板计数法。

1.3.8 挥发性风味物质和香气活性化合物的测定

1.3.8.1 挥发性风味物质的吹扫/捕集-热脱附前处理

挥发性风味物质的前处理方法参考文献[32]。

1.3.8.2 气相色谱-质谱-嗅闻法测定样品中挥发性风味物质

气相色谱条件和质谱条件的设定参考文献[32]。

嗅觉检测器：接口温度150 ℃。用预处理后的样品对3 位评价员培训后进行实验，评价员在嗅觉检测口记录下闻到的气味时间、香味特性及香气强度。3 位评价员的描述一致才可以确定香味活性化合物[20]。

1.3.8.3 挥发性风味成分鉴定

定性：通过软件检索，与NIST谱库提供的谱图鉴定化合物，仅当正反匹配度均大于750（最大值1 000）的鉴定结果才给予列出，并标记为MS；通过系列正构烷烃计算出未知化合物的保留指数（retention index，RI）值，并与文献进行比对，一致者标记为RI；评价员嗅闻到的气味与文献报道的芳香特性对比，相符者予以标记为O。RI值[20]按公式（2）计算：

式中：RI值为样品a的保留指数；Ta为样品a的保留时间/min（在正构烷烃Cn和Cn+1之间）；Tn为正构烷烃Cn的保留时间/min；Tn+1为正构烷烃Cn+1的保留时间/min。

半定量：根据已知内标2-甲基-3庚酮的含量对挥发性组分进行定量分析，计算公式（3）如下所示：

式中：CX为未知挥发性化合物含量/（μg/kg）；CO为内标化合物质量浓度/（μg/μL）；VO为内标化合物进样体积/μL；SX为未知挥发性化合物的峰面积/（AU·min）；SO为添加的内标化合物峰面积/（AU·min）；m为试样的质量/kg。

1.3.9 电子鼻传感器检测[17]

准确量取3 g腊肉瘦肉部分，25 ℃恒温环境平衡30 min，运用PEN3型电子鼻传感器对不同样品进行检测。传感信号在60 s后基本稳定，选定信号采集时间为70 s，每种样品分别做5 次平行重复。

1.4 数据处理与统计分析

所有的测定项目均取自瘦肉部分，Microsoft Excel 2010统计分析数据计算标准差；差异性分析用SPSS软件进行数据分析，采用单因素方差Duncan法分析，P小于0.05为差异显著；电子鼻数据分析运用PEN3型电子鼻配套的Winmuster 软件Version 3.0对两组样品中第70秒采集时间的数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA）[17]。

2 结果与分析

2.1 葡萄球菌发酵剂对腊肉成品中理化特性的影响

表3 葡萄球菌组和空白组腊肉理化指标的变化Table 3 Physicochemical parameters of dry-cured meat made with and without starter culture

水分活度为0.85以下时，一般细菌和酵母菌基本都不能生长[4-5]。由表3可知，两组成品的水分质量分数、水分活度和pH值差异不显著，表明添加葡萄球菌混合发酵剂对产品的水分质量分数、水分活度和pH值基本没有影响。葡萄球菌添加组成品的水分质量分数为41.54%、水分活度为0.813、pH 5.69，基本符合腊肉的贮藏要求。

脂肪的分解和氧化在腌腊制品加工成熟后期的贮藏过程中始终存在，过度氧化会产生酸败和腐臭，影响产品风味。酸价是脂肪中游离脂肪酸含量的标志，可作为脂肪水解程度的指标。由表3可知，葡萄球菌添加组中酸价显著高于空白组，这与已有的报道[32]一致。过氧化值主要是用来评价脂质氧化形成初级氧化产物——脂质氢过氧化物的量。硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acidreactive substance，TBARS）含量主要用来评价脂质二次氧化程度，主要反映了脂质氧化形成的以丙二醛为代表的化合物含量，因此这两个指标常被作为评价食品氧化变质程度的指标。GB 2730—2015《腌腊肉制品》[1]中规定腊肉的过氧化值不大于0.50 g/100 g。Wood等[34]认为当肉品中的TBARS含量超过0.5 mg/kg，肉品就会出现酸败味。由表3可知，两组产品均达到国标的卫生要求，但葡萄球菌组中过氧化值和TBARS含量显著低于空白组（P＜0.05）。

葡萄球菌添加组的酸价高于空白组，说明添加的发酵剂T-SC-200可更快地促进脂肪的分解。而过氧化值和TBARS含量低于空白组，这可能由于木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌混合发酵剂具有抗氧化能力，其在发酵过程中可产抗氧化酶，如过氧化氢酶为过氧化物清除酶，可分解氢过氧化物生成水[35]，抑制其进一步的氧化，因此添加组中脂肪氧化程度显著低于空白组。Chen Qian等[36]也得到相似的结果。

蛋白质水解程度可用蛋白质降解指数表示，蛋白质水解程度太弱，造成产品香味、滋味等较弱，而蛋白质水解过度，产品的味道出现发苦、发酸的现象，严重影响产品品质。由表3可知，与空白组相比，实验组的蛋白质降解指数极显著提高了17.89%（P＜0.01），这与葡萄球菌可分泌蛋白酶，从而酶促进了蛋白质的水解有关[27]。

如表3所示，明度值（L*）和黄度值（b*）在两组中差异不显著，而葡萄球菌添加组的a*显著高于空白组，a*值越大，红色越鲜艳，发色效果越好。表明添加木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌发酵剂对腊肉的发色起到了一定的协助效果。这可能因为发酵剂中的葡萄球菌代谢产生的硝酸还原酶可将亚硝酸盐还原产生NO，NO再与肌红蛋白结合形成亚硝肌红蛋白，或是直接转化高铁肌红蛋白产生具有红色色泽的肌红蛋白衍生物[37-38]。

2.2 葡萄球菌添加组和空白组腊肉成品中微生物分析

图1 添加组和空白组中不同微生物菌落总数的对比Fig. 1 Comparison of total microbial colonies in the inoculated group and the blank group

从图1可明显看出，由于接种了复合发酵剂T-SC-200，接种组腊肉成品中葡萄球菌的菌数达到7.3 （lg（CFU/g）），显著高于空白组（5.8（lg（CFU/g）））（P＜0.05）。其他微生物如乳酸菌、大肠杆菌和菌落总数差异不显著。即使原料肉经过紫外照射降低其初始菌落数，但加工过程中环境以及辅料中微生物的带入，使两组腊肉成品中的乳酸菌数达到107左右的数量级，接近接种组中腊肉成品中的葡萄球菌数，这是由于环境中存在大量的乳酸菌，且其存活力和繁殖能力强，这与已有的研究发现四川腊肉的优势菌为乳酸菌和葡萄球菌[39]相一致。

2.3 添加葡萄球菌组腊肉和空白组成品感官分析

表4 感官评价结果Table 4 Results of sensory analysis

由表4可知，两组在口感方面差异不显著，在色泽、气味和整体接受度方面，发酵剂添加组的色泽更加鲜亮，香味更加浓郁，整体接受度达到9.15 分，评价结果要显著优于空白组（P＜0.05）。说明添加葡萄球菌发酵剂通过发酵使产品的品质得到了提高。

2.4 葡萄球菌发酵剂对腊肉成品中挥发性风味物质以及香气物质的影响

腊肉风味物质来源于脂肪、蛋白质、碳水化合物在腊肉生产过程中所发生的一系列物理生化变化，还与生产所用的原辅料、生产工艺、生产参数等条件密切相关[32]。为研究葡萄球菌发酵剂对挥发性风味物质生成途径的影响，将其挥发性风味物质按照其可能来源分为氨基酸代谢、糖类发酵、微生物酯化和辅料白酒、脂质氧化和其他未知来源物质，结果见表5和图2。经气相色谱-质谱分析，两组腊肉成品中挥发性风味物质共鉴定出57 种，葡萄球菌组中51 种，比空白组（44 种）的数量多7 种，说明葡萄球菌发酵剂可促进挥发性风味物质种类的增加。由图2可知，葡萄球菌组中氨基酸代谢、糖类发酵和微生物酯化所产的挥发性风味物质的种量和总含量均比空白组高，而脂肪氧化源风味物质的总量显著低于空白组；由此说明，添加葡萄球菌发酵剂对促进氨基酸代谢源风味物质的形成具有良好的效果，同时可以延缓脂肪氧化源风味物质的生成速率。

但大部分挥发性化合物没有香气特征，仅有13 种香气化合物由嗅闻检测器检测到，其中包括氨基酸代谢源（3-甲基丁醛、苯乙醛、3-甲基丁酸）3 类，微生物酯化和辅料白酒物质（乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯）5 类，脂质氧化（己醛、庚醛、壬醛、2-庚醇、1-辛烯-3-醇）5 种，还有一种质谱未能检测到但香气强烈未知物，构成了腊肉的整体香气。与空白组相比，葡萄球菌添加组特有的香气化合物是3-甲基丁醛（巧克力、麦芽香）、3-甲基丁酸（酸、臭）、2-甲基丁酸乙酯（水果香）、己酸乙酯（窖香、水果香）4 种；其显著增加了样品中3-甲基丁酸乙酯（甜香、脂香）化合物的含量，还显著降低了己醛（青草味）、壬醛（脂肪、植物、绿草）这两种脂肪氧化源风味物质的含量。有研究表明，葡萄球菌代谢支链氨基酸生成相应的醇、醛、酸，如3-甲基丁醇来源于亮氨酸[40]。

表5 葡萄球菌添加组和空白组腊肉成品中香气风味物质的对比结果Table 5 Quantitative and qualitative comparison of aroma compounds in the inoculated group and the blank group

续表5

图2 葡萄球菌组和空白组腊肉中不同可能来源的挥发性风味物质总量Fig. 2 Comparison of contents of volatile compounds from different sources in the inoculated group and the blank group

2.5 电子鼻分析

图3 葡萄球菌添加组和空白组腊肉成品中PCAFig. 3 PCA analysis of volatile fl avor compounds in the inoculated group and the blank group

如图3所示，PCA中各组分析数据点均分布在各自的区域内，没有重叠现象，PC1、PC2的方差贡献率分别为89.04%和8.9%，总贡献率达97.94%，表明2个主成分基本代表了样品的信息，由此说明添加葡萄球菌发酵剂的腊肉样品的风味变化明显。

3 结 论

本实验通过添加木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌混合发酵剂制作腊肉，研究其对产品理化、微生物、感官特性和香气化合物的影响。发现葡萄球菌发酵剂对成品的水分含量、水分活度、pH值没有显著影响。与空白组比，葡萄球菌发酵剂可显著提高产品的酸价、蛋白质降解指数、红度值a*、香气和接受度得分及氨基酸代谢源风味化合物的种类和含量（3-甲基丁醛、3-甲基丁酸），显著降低了过氧化值、TBARS含量和脂肪氧化源风味化合物的含量（己醛、壬醛）。电子鼻传感器能够将2 组产品区分开，说明加入发酵剂后，腊肉的风味有所改变。因此，通过添加葡萄球菌发酵剂可以促进蛋白质和脂肪的水解、改善腊肉的色泽，促进风味快速形成，同时延缓脂肪氧化，最终显著影响产品的品质。通过添加葡萄球菌发酵剂改进工业化腊肉的生产工艺是切实可行，既可以缩短产品的生产周期，又提高产品品质，满足工业化腊肉的加工要求。