边林莉 丁丹红 方红明

蒽环类药物（anthracycline，ATC）目前广泛用于乳腺癌化疗中，临床以阿霉素、表阿霉素（epirubicin，EPI）最为常用。ATC在杀伤肿瘤细胞的同时，也会直接或间接损害患者的心肌细胞，进而导致肿瘤治疗相关的心血管毒性[1-2]。ATC诱导的心脏毒性以心肌细胞损伤最为常见，如何减轻或消除ATC的心脏毒性是亟需解决的问题。本研究建立EPI致大鼠心肌损伤模型，探讨中等强度有氧运动（moderate-intensity aerobic exercise，MIAE）对大鼠心肌损伤的保护作用，为EPI所致心肌损伤的治疗提供依据，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雌性健康SD大鼠40只，体重（180±20）g，购自上海斯莱克有限公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002，合格证号：0302607。饮用水为二级纯化水。实验动物房使用许可证号为SYXK（浙）2015-0008。饲养环境：温度20～25℃，相对湿度40%～70%。实验开始前先让大鼠在动物房环境中适应7d。维持饲料由江苏协同生物工程有限公司提供，执行标准GB14924.4-2001《实验动物大小鼠配合饲料》。

1.1.2 药品及试剂 0.9%氯化钠溶液（山东齐都药液有限公司，批号：3B151014124）；盐酸 EPI注射液（辉瑞制药有限公司，批号：N97871）；右丙亚胺（dexrazoxane，DEX）注射液（苏奥赛康药业股份有限公司，批号：E1611022）；无水乙醇（成都市科龙化工试剂厂，批号：2015061501）；戊二醛（成都市科龙化工试剂厂，批号：2014011101）；B 型钠尿肽（BNP）检测试剂盒（武汉优尔生物公司，cat#SEA478Ra，lot#L170718667）；心肌肌钙蛋白（TNNI3）检测试剂盒（武汉优尔生物公司，cat#CEA541Ra，lot#L170718659）。

1.1.3 主要仪器 动物实验跑台（安徽正华生物仪器设备有限公司，型号：ZH-PT），共5条跑道，跑道之间用有机玻璃隔开，跑台单道尺寸750mm×90mm×120mm，跑道后有声、光、电刺激装置，刺激电流0.05～4.00mA，跑速 0～40m/min。冰箱（YCD-EL259，中科美菱公司）；超低温冰箱（DW-86L388，青岛海尔公司）；轮转式切片机（RM2235型，LEICA公司）；病理组织漂烘仪（Tec 2500型，常州市郝思琳仪器设备有限公司）；显微镜（BX43型，奥林巴斯公司）；电磁炉（C21-SDHC15K型，浙江绍兴苏泊尔生活电器有限公司）；隔水式恒温培养箱（PYXDHS500BS-Ⅱ型，上海跃进医疗器械有限公司）；全波长酶标仪（SpectraMax Plus 384型，MD公司）；透射电镜（TECNA-10，荷兰飞利浦公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠造模与分组 按随机数字表法将40只SD大鼠分为正常对照组8只、心肌损伤组32只。（1）正常对照组按1.7ml/kg剂量尾静脉注射0.9%氯化钠注射液，1次/周，连续注射6周。（2）心肌损伤组按3mg/kg剂量尾静脉注射EPI注射液，1次/周，连续注射6周；造模过程中有4只大鼠死亡。给药6周后再隔1周，采用ELISA法测定两组大鼠血清TNNI3、BNP，心肌损伤组大鼠血清TNNI3、BNP水平高于正常对照组为造模成功。再按随机数字表法将心肌损伤组28只大鼠分为模型组、DEX组、MIAE组、DEX+MIAE组，每组7只。

1.2.2 治疗方法 （1）正常对照组、模型组按3ml/kg剂量尾静脉注射0.9%氯化钠溶液，1次/周，连续注射6周。（2）DEX组按30mg/kg剂量尾静脉注射DEX注射液，1次/周，连续注射6周。（3）MIAE组大鼠经3d适应性训练后，由专人在同一时间给予训练，第1周跑台速度为15m/min，时间25min，随后每周逐渐增加运动强度，至第6周跑台速度为24m/min，时间30min，运动强度64%～76%VO2max；1次/d，每周训练 5d，连续训练 6周。DEX+MIAE组按30mg/kg剂量尾静脉注射DEX注射液，1次/周；同时配合MIAE，训练方法与MIAE组相同；连续治疗6周。

1.2.3 血清TNNI3、BNP检测 治疗6周后取大鼠安静时尾静脉血0.5ml，利用离心机制备血清标本，采用ELISA法检测各组大鼠血清TNNI3、BNP水平。

1.2.4 HE染色及电镜观察 治疗6周后，大鼠断头处死，剖腹取大鼠心室心肌组织（左心室壁及室间隔结构）放入4%甲醛溶液中固定，然后脱水、包埋、切片、HE染色，于光镜下观察。另取＜1mm3心室组织块，通过固定、脱水、包埋、固化、修块、超薄切片（约120nm）、染色后，置于单孔铜网上，在透射电镜下观察并拍照。

1.3 统计学处理 应用SPSS 20.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠基本情况 正常对照组大鼠在实验期间精神、进食、毛发情况均良好，体重平稳增加。心肌损伤组大鼠尾静脉连续注射EPI注射液后，精神萎靡，毛发无光泽且出现脱毛现象，部分大鼠尾巴出现肿胀或坏死、尾尖脱落等情况；随着时间延长，大鼠状态越来越差，进食量减少，体重减轻，造模过程中有4只大鼠死亡。治疗期间，模型组、DEX组各有1只大鼠死亡，MIAE组、DEX+MIAE组各有2只大鼠死亡。

2.2 各组大鼠治疗后血清TNNI3、BNP水平比较 治疗6周后各组大鼠血清TNNI3、BNP水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。进一步两两比较发现，正常对照组TNNI3、BNP水平低于模型组、DEX组、MIAE组、DEX+MIAE 组（均P＜0.05），DEX组、MIAE 组、DEX+MIAE组TNNI3、BNP水平均低于模型组（均P＜0.05），DEX+MIAE组TNNI3、BNP水平低于DEX组、MIAE组（均P＜0.05）；DEX 组与 MIAE 组 TNNI3、BNP水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠治疗后血清TNNI3、BNP水平比较（pg/ml）

2.3 各组大鼠心肌细胞HE染色结果比较 正常对照组心肌细胞排列规则紧密。模型组心肌细胞空泡变性、

水肿，细胞间隙明显增宽，部分心肌细胞核溶解坏死，有少量炎症细胞浸润，以淋巴细胞和单核细胞为主。DEX+MIAE组病变程度最轻，偶可见少量中性粒细胞浸润；DEX组次之，可见心肌细胞水肿发生，空泡及变性坏死较少；MIAE组治疗效果差于DEX组，空泡变性病变较多，见图1。

2.4 各组大鼠治疗后心肌细胞电镜观察结果比较 正常对照组心肌细胞细胞核及染色质分布均匀，肌纤维肌丝排列致密，闰盘结构规则清晰，线粒体脊清晰可见。模型组心肌细胞凋亡，染色质聚集，肌丝断裂，闰盘排列紊乱，线粒体与心肌肌丝之间有空泡。DEX组心肌细胞的组织结构较MIAE组好；3个治疗组中，DEX+MIAE组心肌细胞的组织结构与正常对照组最为接近，见图2。

图1 各组大鼠治疗后心肌细胞HE染色结果比较[a：正常模型组，心肌细胞空泡变性、水肿（箭头所示）；b：模型组，心肌细胞空泡变性、水肿（箭头所示）；c：DEX组，心肌细胞空泡变性、水肿（箭头所示）；d：MIAE组，心肌细胞空泡变性、水肿（箭头所示）；e：DEX+MIAE组，中性粒细胞浸润（箭头所示）；×200]

图2 各组大鼠治疗后心肌细胞电镜观察结果比较（a：正常模型组；b：模型组；c：DEX组；d：MIAE组；e：DEX+MIAE组；×8 300）

3 讨论

使用ATC化疗虽能明显提高乳腺癌患者的治愈率及生存率，但药物不具备靶向性，可引起多种毒性反应，其中以心脏毒性尤为突出，且与剂量相关；同时，ATC对心脏的损伤是进行性、不可逆的，可导致患者心肌细胞变性、坏死，出现明显的心功能不全（通常在用药后3个月内出现）[3]。DEX是目前唯一可以有效预防ATC导致心脏毒性的药物，且对抗肿瘤治疗无明显影响，一般不产生新的毒性或增加ATC的毒性程度，因此临床上常使用DEX来保护患者的心脏功能[4-5]。

有氧运动训练对心血管疾病的益处已有大量医学证据支持。2016年欧洲心脏病学会关于心力衰竭的治疗指南中强烈推荐慢性心力衰竭患者进行规律的有氧运动，可降低其再住院风险及病死率。适宜的有氧运动能促进Bcl-2、HIF-1α基因的表达，减少Bax基因表达，从而有效减少心肌细胞死亡[6]。但力竭性运动起着相反的作用，运动后患者血清丙二醛水平明显增加、超氧化物歧化酶活性明显降低，可引起机体内源性氧自由基脂质过氧化反应增强，破坏机体正常功能的平衡[7]。龚彦豪等[8]发现有氧运动可维持细胞膜的结构稳定性及完整性，改善机体供氧能力，从而减轻氧自由基对心肌造成的损伤，对心肌具有保护作用。有文献报道，适度的有氧运动能有效改善心肌梗死大鼠病理性心脏重塑及线粒体功能紊乱[9]；也能有效增加心力衰竭患者最大摄氧量，改善有氧运动能力[10-11]。

TNNI3是一种调节蛋白，也是心肌收缩不可或缺的蛋白，它参与心肌收缩偶联过程中钙的激活和调节，具有灵敏度和特异度均较高的特点，可反映心肌早期病变，对心力衰竭的诊断、病情评估、治疗与预后判断具有重要意义[12]。TNNI3可作为心肌损伤特有的监测指标[13]。BNP属于内源性肽类神经激素，主要由心室分泌；发生充血性心力衰竭时，BNP浓度可升至极高，与心力衰竭的程度密切相关[14]。在EPI致心肌损伤大鼠模型中，笔者采用TNNI3、BNP作为心肌损伤的标志物来评价左室功能失调情况。本研究结果显示，使用EPI造模的大鼠血清TNNI3、BNP水平急剧升高，HE染色及电镜结果也支持这种改变。经6周治疗后，DEX组、MIAE组、DEX+MIAE组大鼠血清TNNI3、BNP水平较模型组明显下降，这提示DEX、MIAE、DEX+MIAE对心肌损伤均有不同程度的保护作用。以上3种干预方式比较，DEX+MIAE组大鼠血清TNNI3、BNP水平下降最为明显，这说明DEX+MIAE对心肌的保护作用优于DEX组、MIAE组。HE染色结果提示DEX+MIAE组的病变程度最轻，DEX组次之，MIAE组较为严重；电镜检查结果也提示DEX组心肌细胞的组织结构好于MIAE组，其中DEX+MIAE组心肌细胞的组织结构与正常对照组最为接近。虽然经DEX、MIAE、DEX+MIAE干预后，大鼠血清TNNI3、BNP水平较模型组明显下降，但与正常对照组比较仍明显较高，可见EPI致心肌损伤大鼠经治疗干预后，仍存在不同程度的心肌损伤。

综上所述，DEX、MIAE、DEX+MIAE 对 EPI致大鼠心肌损伤均有心肌保护作用，以DEX+MIAE最为明显；但治疗干预后，仍存在不同程度的心肌损伤。因此，在临床上使用EPI治疗乳腺癌时，医生仍需高度重视其产生的心脏毒性。