王海燕，覃 明，王克跃

(1.遵义医学院 公共卫生学院流行病与统计学教研室，贵州 遵义 563099; 2.遵义医学院 免疫学教研室贵州省研究生教育创新基地，贵州 遵义 563099)

镉(Cadium，Cd)是一种重金属污染物，被国际癌症机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)确认为肺癌和前列腺癌的致癌物[1]，亦具有强大的诱癌能力，可造成人和动物多器官或系统的毒性损伤。Cd被广泛应用于电镀、电池、颜料及某些电子产品等工业生产中，目前，镉元素已普遍存在于大气、水体和土壤中[2]。人群Cd污染可通过职业暴露、空气吸入[3]、食物[4]、水及皮肤接触等多种途径进入人体。研究证实慢性镉中毒时，摄入Cd的8%会经胃肠吸收[5]。Cd进入机体可通过生物放大和蓄积，动物机体内半衰期长达7～35年[6]，Cd经吸收后主要与金属硫蛋白(MT)结合形成Cd-MT复合物，对肾、肝、肺、骨、生殖系统、免疫系统等产生一系列损伤[7-10]。肝脏和肾脏是Cd中毒的主要靶器官，研究证实，急性Cd中毒可以增加脂肪肝和非酒精性肝炎的发生率[11]，对肾脏的损伤易形成肾小管功能障碍和不可逆的肾损伤[12]。我国的土壤和水中的Cd污染严重，大大增加了人群Cd中毒的风险，研究表明，日常Cd水平的摄入，就可能引起普通人群肾功能的损伤[13]。Cd的毒性作用机理与脂质过氧化有关，还可直接作用于靶部位，甚至影响体内必需元素的正常代谢进而影响其所介导的功能，例如Cd可通过竞争性的替换Ca2+、Fe2+、Zn2+等金属离子在细胞膜转运蛋白上的结合位点，改变膜的通透性而进入细胞内[14]。

锌(Zinc，Zn)是人体必需的微量元素，亦是机体内几百种酶的重要组成部分,它能稳定细胞膜，也是维持自由基平衡的铜锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD)的组成成分。Zn与金属蛋白的复合物能清除氧自由基，其本身也有抗脂质过氧化的作用[15]，Zn还能稳定溶酶体、线粒体、微粒体的膜结构，对脂质过氧化有阻抑作用[16]。Zn与Cd是同族(ⅡB)相邻元素，理化性质相似，在吸收、分布和排泄的不同阶段均存在不同程度的相互影响。近年来研究表明，Zn对Cd所致大鼠含锌酶活性降低有保护作用[17]，Cd能影响前列腺PC3细胞膜中上的ZnT1mRNA的表达[18]，体外试验也表明Cd对某些锌转运体有影响[18]。本研究旨在利用整体动物通过预补Zn，分析预补Zn对Cd引起的肝肾损伤的作用及Zn内稳态的改变情况。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 氯化镉(AR，上海试剂二厂)，硫酸锌(AR，天津市大茂化学试剂厂)，巯基乙醇(Bio Basic INC，mercaptoethanol，ME)，水中镉、锌标准物(上海市计量测试研究所)，尿肌酐试剂盒(荣盛生物公司)，尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG)活性测定试剂盒(上海太阳生物公司)，β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究生所)，微量丙二醛(MDA，malonaldehyde)、总抗氧化能力(T-AOC，Total Anti-oxygen Capacity)、超氧化物歧化酶(SOD，superoxide dismutase)、谷丙转氨酶(GPT，glutamic phyuvic transaminase)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、白蛋白(ALB，albumin，)和总蛋白(TP，total protein)均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。

原子吸收光谱仪(PE公司，美国)，GC-2010型自动放免仪(中国科大中佳公司)，HITACHI7170A生化分析仪(日本日立公司)，荷兰飞利浦TECNAI10-透射电镜、AU2700全自动生化分析仪(日本OLYMPUS公司)，大鼠代谢笼(江苏省苏州市冯氏实验动物设备有限公司)。实验过程中所用玻璃仪器均需要泡酸处理12 h以上。

1.2 实验动物模型建立 清洁级SD大鼠32只，体重(252.4±20.2)g，由重庆第三军医大学动物实验中心提供，饲养适应1周后，随机分为4组：空白对照组、补锌组、染镉组和补锌+染镉组。所有补锌组均饮用含300 mg(Zn2+)/L的去离子水(由硫酸锌配制)，其他组饮用不含锌的去离子水，饲养14 d后，空白对照和单独补锌组腹腔注射生理盐水，所有染镉组一次性给予腹腔注射CdCl2(15 μmol/kg)+ME(300 μmol/kg)混和液，使Cd2+的浓度为2 mg/kg体重，建立急性镉肝肾中毒模型。

1.3 样品收集及指标测定

1.3.1 尿样大鼠染镉后置于代谢笼中，在冰浴下收集前12 h和后12 h尿液，尿样于-80 ℃保存待测，补锌组及对照组采用同样方法处理。尿镉采用无焰原子吸收法测定；尿β2-MG用放射免疫法测定；尿NAG的活性用对-硝基苯酚比色法测定；尿肌酐(UCr，urinary creatinine，)用苦味酸法测定；尿TP用溴甲酚绿法测定；ALB用WeichseLbaum修改法；按试剂盒说明提供的方法操作。

1.3.2 全血和血清 收集尿液24 h，戊巴比妥纳(1%)腹腔注射麻醉(40 mg/kg)大鼠，断头处死，采用自制的肝素钠EP管收集全血约1 mL，其余血液分离血清，于-80 ℃保存待测相应的指标。血清中AKP活性及血清锌的测定采用全自动生化分析仪。血液采用硝化法硝化后用无焰原子吸收法测定镉离子的浓度。

1.3.3 肝肾组织 大鼠断头处死后，75%酒精腹部消毒，快速切取约1 mm3的肝肾组织块放入2.5%戊二醛中固定，4 ℃保存；切取厚度约2 mm3的肝肾组织放入10%甲醛固定液中固定，4 ℃保存；取肝组织约0.5 g，肾皮质约0.2 g，并准确记录重量，-80 ℃保存，用于制作组织匀浆测定相应的指标。

取已称重肝肾组织，采用硝化法硝化，然后用无焰原子吸收法测定镉、锌离子浓度。制备组织匀浆测定肝组织中MDA的含量、SOD活性、AKP活性和肾脏中T-AOC的活性。肝肾组织中蛋白测定分别用考马斯亮蓝法和双缩脲法。

2 结果

2.1 血清及肝肾组织中锌含量测定结果 与空白对照组比较，补锌组肝肾组织中锌含量明显升高；染镉组肝肾组织锌含量升高，而血清锌降低；补锌+染镉组肝肾组织锌含量升高，血清锌降低。与染镉组比较，补锌+染镉组血清锌升高，肝锌和肾锌升高，差异均有统计学差异(P<0.05，见表1)。

分组血清锌(μg/L)肝锌(μg/g)肾锌(μg/g)空白对照30.28±8.7439.58±4.1334.76±3.84补锌31.63±6.8452.46±9.37a43.60±3.40a染镉9.50±2.58ab47.98±3.88a40.46±2.42a补锌+染镉20.40±4.47abc61.24±5.52ac53.78±2.53ac

a：与对照组比较，P<0.05；b：与补锌组比较，P<0.05；c：与染镉组比较，P<0.05。

2.2 尿、血液及肝肾组织中镉含量测定结果 染镉组的尿、血及肝肾组织中镉含量较空白对照组和补锌组明显升高；预先补锌后，尿及肝肾组织中的镉含量明显升高，血液中的镉含量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

分组尿镉[μg/g(Cr)]血镉(μg/L)肾镉(μg/g)肝镉(μg/g)空白对照73.31±8.000.41±0.130.43±0.110.51±0.23补锌75.78±6.440.37±0.190.65±0.120.75±0.11染镉 912.39±128.74ab6.17±1.07ab127.02±21.17ab774.38±155.10ab

a：与对照组比较，P<0.05；b：与补锌组比较，P<0.05；c：与染镉组比较，P<0.05。

2.3 尿NAG的活性及尿β2-MG、尿TP和尿ALB的含量测定结果 与空白对照组比较，染镉组尿β2-MG、尿TP和尿ALB的含量升高，尿NAG活性上升；补锌染镉后，与染镉组比较，尿β2-MG、尿TP和尿ALB的含量较染镉组下降，尿NAG活性下降，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

分组尿NAG[U/g(Cr)]尿TP(g/L)尿ALB(g/L)尿β2-MG[Ug/g(Cr)]空白对照160.86±60.6214.42±3.432.64±0.782.85±1.15补锌175.54±30.3514.45±5.172.36±0.921.94±1.08染镉2326.88±968.54ab 208.09±42.90ab 70.76±11.61ab 7.85±3.37ab补锌+染镉1312.45±435.74abc 118.97±32.37abc 41.06±7.89abc 3.43±1.25abc

a：与对照组比较，P<0.05；b：与补锌组比较，P<0.05；c：与染镉组比较，P<0.05。

2.4 肾脏中T-AOC、SOD活性及MDA含量测定 与空白对照组比较，补锌组T-AOC的活性升高，染镉组肾SOD、T-AOC的活性下降，MDA含量上升；与染镉组比较，补锌染镉组肾SOD、T-AOC的活性较染镉组回升，MDA的含量下降，差异有统计学意义(P<0.05，见表4)。

分组T-AOC[单位/mg(prot)]MDA[nmol/mg(prot)]SOD[U/mg(prot)]空白对照11.56±2.841.29±0.1727.19±4.71补锌13.82±5.14a1.28±0.2527.91±3.97染镉6.99±1.52ab2.68±0.48ab16.89±1.82ab补锌+染镉10.16±1.88c1.57±0.14c26.45±4.10c

a：与对照组比较，P<0.05；b：与补锌组比较，P<0.05；c：与染镉组比较，P<0.05。

2.5 血清中GPT和AKP的活性测定结果 与空白对照组比较，染镉组血清AKP活性下降，而血清GPT的活性升高；与染镉组比较，补锌染镉组的AKP和GPT的改变刚好相反，差异有统计学意义(P<0.05，见表5)。

2.6 肝脏中MDA含量及SOD、AKP活性测定结果 与空白对照组比较，染镉组SOD、AKP的活性下降，MDA含量升高；与染镉组相比，补锌染镉组SOD、AKP及MDA的改变刚好相反，差异有统计学意义(P<0.05，见表6)。

分组血清GPT(U/L)血清AKP(U/L)空白对照63.50±9.61 140.75±26.16补锌57.38±17.01145.75±31.84染镉142.75±23.96ab80.75±11.83ab补锌+染镉97.25±23.38abc92.63±21.74ab

a：与对照组比较，P<0.05；b：与补锌组比较，P<0.05；c：与染镉组比较，P<0.05。

分组MDA[nmol/mg(prot)]SOD[U/mg(prot)]AKP[U/g(prot)]空白对照0.34±0.0714.62±2.230.55±0.16补锌0.28±0.0715.39±3.490.79±0.21染镉0.54±0.06ab9.68±2.13ab0.22±0.11ab补锌+染镉0.42±0.06abc13.41±2.93c0.38±0.08abc

a：与对照组比较，P<0.05；b：与补锌组比较，P<0.05；c：与染镉组比较，P<0.05。

2.7 大鼠体内镉含量与锌离子的分布及与反映肾损伤指标之间的相关性 血清锌与血镉、尿NAG的活性、尿β2-MG 、尿ALB及尿TP的含量负相关；肾锌与SOD、T-AOC、血清AKP正相关，与MDA负相关(见表7)。

表7锌分布与肾脏损伤指标及脂质过氧化指标间的相关分析

变量尿β2-MG尿TP尿ALB尿NAG血CdSODMDA血AKPT-AOC肾Zn-0.030.210.110.300.160.70*-0.74*0.62*0.66*血清Zn-0.77*-0.79*-0.77*-0.73*-0.77*----

*：P<0.01。

2.8 肾脏组织形态学观察结果

2.8.1 光镜检查结果 空白对照组和补锌组肾组织未见异常改变，肾小球、肾小管完好(见图1A，1B)；染镉组肾小管上皮细胞明显坏死、变性，呈萎缩弥漫性坏死，坏死组织中可见棕黄色金属复合物晶体沉淀，细胞正常结构看不到(见图1C)；补锌染镉组肾皮质细胞轻微的变性，未见坏死，可见结构基本正常的肾小球组织(见图1D)。

A：空白对照组；B：补锌组；C：染镉组；D：补锌染镉组。图1 肾脏组织HE染色结果(×400)

2.8.2 肾脏组织透射电镜观察结果 空白对照组和补锌组的肾组织均未见差异，肾小球规则、完整，微绒毛规则整齐，细胞核完整(见图2A，2B，3A，3B)；染镉组的线粒体肿胀，嵴紊乱模糊，脂肪变性明显，微粒体扩张明显、紊乱、层次不清(见图2C，3C)；与单独染镉组比较，补锌染镉组的线粒体肿胀、脊紊乱、脂肪变性的程度较轻微，微绒毛和微粒体较规则(见图2D，3D)。

A：空白对照组；B：补锌组；C：染镉组；D：染镉补锌组。图2 肾脏组织电镜观察(×3 700)

A：空白对照组；B：补锌组；C：染镉组；D：补锌染镉组。图3 肾脏组织电镜观察结果(×12 500)

3 讨论

结果显示染镉组大鼠尿中NAG的活性明显降低，尿β2-MG和尿TP的含量升高，病理改变显示染镉后导致明显肾小管损伤，引起了大鼠的急性肾损伤，表明镉肾损伤模型建立成功。染镉组光镜下观察到肾小管上皮细胞明显坏死，看不到细胞正常结构，而预补锌后染镉虽可观察到肾小管上皮细胞坏死，但正常的细胞结构可见，损伤较轻微，说明镉的急性损伤以肾小管上皮细胞损伤为主要靶器官。电镜下观察染镉后线粒体肿胀，嵴紊乱模糊，脂肪变性明显，微粒体扩张明显，层次不清楚，微绒毛紊乱等，而预补锌后染镉微绒毛和微粒体较规则，线粒体的肿胀、脊紊乱、脂肪变性的程度有所改善，肝组织的形态学结果也观察到同样的改变(图略)。以上形态学的观察提示预补锌对肝镉引起的肾损伤有一定的拮抗作用，染镉组肾脏中T-AOC、SOD的活性和肝脏中AKP、SOD的活性均下降，肝肾中MDA含量升高，肝脏中Zn含量升高，肾脏中Zn含量也呈上升趋势，而血清中Zn降低；且血清锌与血镉、尿NAG的活性、尿β2-MG、尿ALB及尿TP的含量负相关，肾锌与SOD、T-AOC、血清AKP正相关，与MDA负相关，提示镉引起的这种损伤与脂质过氧化、抗氧化能力下降和锌内稳态的改变有关。大鼠染镉后，染镉组肝肾组织中Zn含量呈上升趋势，而血清中Zn含量降低，考虑是染镉后机体将血液中Zn2+转运至肝脏和肾脏中，从而改变了锌2+的分布。生理状态下，锌金属巯蛋白(Zn-MT)是体内Zn的储存库，是可利用的Zn供体[19]，Cd被机体吸收以后与MT结合的能力大于Zn2+，染Cd组，Cd进入细胞后将Zn-MT中的Zn置换出来形成Cd金属巯蛋白(Cd-MT)，Zn由线粒体、胞桨向细胞核转移[20]，Cd将Zn-MT中的锌离子置换出来，使细胞内可利用的锌含量减少，作为一种保护机制，机体将血清中的Zn向肝脏转移，作为一种代偿机制，锌的这种改变有利于镉毒性产生结抗。预补锌后再染镉，尿中NAG的活性明显升高，β2-MG和尿TP的含量降低，同时肝脏中AKP、SOD的活性和肾脏中T-AOC、SOD的活性均上升，肝肾中MDA的含量降低，表明预补锌后，减缓了肝肾组织的过氧化程度，对镉引起的肝肾毒性有保护作用，与之前的研究结果相同。

综上所述，急性镉染毒引起肝肾脏损伤，预补锌能拮抗镉引起的肝肾毒性，该损伤与体内锌离子分布状态的改变有关。这一研究结果亦提示我们进一步探讨镉急性毒性与锌离子及锌转运体表达的关系具有重要意义。