张学英 章发盛 黄静 彭俊 张祖圆

摘 要：采用比色法测定青钱柳叶总黄酮（以芦丁计）的含量。对三氯化铝醋酸钾和硝酸铝2种比色法进行比较分析，确定三氯化铝醋酸钾比色法为青钱柳叶总黄酮最佳测定方法，该方法重现性好，精密度和加标回收率高，其RSD分别为1.00%、2.87%和3.06%，4h内显色反应体系稳定性好，标准曲线为Abs =0.2855×C -0.00281，相关系数为0.99926，在0.2～8.0ug/mL范围内符合朗伯比耳定律。本方法适用于青钱柳代用茶中总黄酮的质量分析和质控依据。

关键词：青钱柳叶；总黄酮；三氯化铝醋酸钾比色法；硝酸铝比色法；方法研究

中图分类号：S-3 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180732001

青钱柳Cyclocarya paliurus （ Batal）Iljinsk）为胡桃科青钱柳属植物，别名铜钱树、摇钱树、青钱李、金钱柳等，为我国特有树种，属国家二级保护树种。主要生长于中国南部海拔 420～2500m 的高山地区，是一种药食两用的植物，其根、枝、叶均可入药，可用作传统中药制剂。现代药学研究表明青钱柳具有生津止渴、清热解毒、降三高、抗氧化、提高人体免疫力等功效[1]。陈玮玲等研究表明青钱柳中含有有机酸、酚酸、黄酮、三萜、皂苷类和酯类等，其中酚酸和黄酮类化合物是主要的抗氧化活性成分[2]。青钱柳叶在食品加工领域中作为新食品原料（中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2013年第10号公告），一般用青钱柳嫩叶作为代用茶原材料，在我国湖南、江西等省份己有部分企业获得青钱柳代用茶食品生产许可证（国家市场监督管理总局网站可查询）。

黄酮类化合物是一类植物中分布很广而且重要的多酚类天然产物，泛指2个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物[3]。黄酮类化合物具有广泛的药理活性，如抗菌作用、抗氧化作用和抗自由基作用等[4]。

食源性植物、药源性植物、保健食品和食品中总黄酮的测定方法主要有直接测定法、薄层色谱法、 高效液相色谱法、毛细管电泳法、紫外分光光度法等，高效液相色谱法常用于检测黄酮单体，比色法常用于检测总黄酮量，比色法一般快速、简单、准确，常用比色法（以芦丁计）有直接比色法（360nm）、三氯化铝比色法（312nm）、三氯化铝比色法（416nm）[5] 、三氯化铝醋酸钾比色法（415nm）、硝酸铝亚硝酸钠氢氧化钠比色法（510nm）等。经查文献资料，未见关于青钱柳叶中总黄酮三氯化铝醋酸钾比色法（本文简称三氯化铝法）和硝酸铝亚硝酸钠氢氧化钠比色法（本文简称硝酸铝法）的比较研究。本文通过光谱扫描、方法评价等验证，比较分析三氯化铝比色法和硝酸铝比色法在青钱柳叶总黄酮（以芦丁计）检测中的应用，建立一套准确、简便、灵敏、重现性好的青钱柳总黄酮检测方法，为青钱柳代用茶及其总黄酮的开发应用提供检测方法、应用基础和质控标准。

1 仪器、试剂等试验材料

1.1 仪器

UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津）；BSA-224S分析天平、电热恒温水浴锅、KQ5200V型超声波清洗器、常用玻璃器皿等。

1.2 试剂

醋酸钾（AR，含量≥92.0%）；冰醋酸（AR，含量≥99.5%）；三氯化铝（AR，含量≥99.0%）；硝酸铝（AR，含量≥99.0%）；亚硝酸钠（优级纯，含量≥99.0%）；氢氧化钠（优级纯，含量≥98.0%）；无水乙醇（UV-HPLC，含量≥99.9%；AR，含量≥99.7%）；甲醇（HPLC，含量≥99.9%；AR，含量≥99.5%）；2.5g/100mL三氯化铝（备注：本试验所用自配试剂均表示为水溶液）；9.82g/100mL醋酸钾； 10g/100mL硝酸铝；5g/100ml亚硝酸钠； 20g/100mL氢氧化钠。

1.3 标准品

以中药对照品芦丁为标准品（CAS号153-18-4，含量98.41%，生产商：北京世紀奥科生物技术有限公司）；标准贮备液Ⅰ：称取0.0100g干燥恒重芦丁用95%乙醇溶解定溶至100mL容量瓶中，配成100ug/mL标准贮备液Ⅰ；标准贮备液Ⅱ：标准贮备液Ⅰ用95%乙醇稀释5倍，配成20ug/mL标准贮备液Ⅱ。

1.4 试验样品

试验样品来源于湘食药科[R201726]课题的科研样品和古丈春风合民族食品开发有限公司（青钱柳代用茶成品）。科研样品为不同季节科研人员现场采摘鲜叶，在试验室进行简单加工：通风阴干（阴干或160～180℃杀青15min后阴干）→60℃恒温复干1h→粉碎过60目筛。

2 实验方法及验证

2.1 基础试剂验证

2.1.1 实验用水验证

用UV-2550仪对检验用纯净水和超纯水进行200～700nm波长扫描，结果发现2种水在扫描波长范围内均无明显吸收峰，且2种试验用水在220～700nm光谱图平直一致。可见试验用纯净水和超纯水对本试验无影响。即本试验用纯净水即可。

2.1.2 实验用有机溶剂验证

通过验证甲醇（液相色谱纯原液、AR市售原液、90%AR自配、70%AR自配）和乙醇（液相色谱纯原液、AR市售原液、95%市售原液、90%AR自配、60%AR自配、30%AR自配）200～700nm波长扫描，结果为乙醇（6种）和甲醇（液相色谱纯原液）在220～700nm均无明显吸收峰，且光谱图平直一致见图1和图2。但甲醇（AR市售原液、90%AR自配、70%AR自配）在260～265nm处有较小的吸收峰见图2。综合考虑试剂对本试验的影响、甲醇有机溶剂的毒性及液相色谱纯试剂成本等因素。故本试验有机溶剂选择AR及自配的不同浓度乙醇较佳。

2.1.3 标准品紫外鉴别[6]