张丽娟　曲继松　朱倩楠　李堃

摘 要： 為探索茖葱种子萌发条件及其对PEG-8000处理的响应，同时测定不同生长调节剂配方对茖葱不定芽分化的影响。以前一年和当年茖葱种子为材料，采用培养皿滤纸卷法进行种子萌发试验；以茖葱鳞茎为外植体进行不定芽诱导分化。结果表明，10%（w）的PEG-8000处理可明显促进前一年茖葱陈种子发芽，发芽率94.00%、发芽指数0.89。随PEG-8000质量分数的增加，茖葱种子的发芽率、发芽势及发芽指数有所降低；低温层积50 d及PEG-8000浸种能显著促进茖葱当年新种子萌发，沙藏层积50 d，再用200 mg·L-1 PEG-8000浸种4 h，发芽启动时间及发芽高峰期提前最多，发芽持续时间缩短10 d左右，与CK相比，发芽势、发芽率及发芽指数分别提高了475.00%、65.52%及93.75%，对促进茖葱种子发芽的效果最好，同时PEG-8000浸种能显著减少种子层积后的烂种数。筛选出MS+6-BA 1.5 mg·L-1 +2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1为供试方案中的最优培养基配方，分化率为56.56%。

关键词： 茖葱； 种子发芽； PEG-8000； 直接分化； 不定芽诱导

Effect of different preparations on induction of adventitious buds on the germination and direct differentiation of Allium victorialis L. seeds

ZHANG Lijuan， QU Jisong， ZHU Qiannan， LI Kun

（Institute of Germplasm Resources， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Science， Yinchuan 750002， Ningxia， China）

Abstract： In order to explore the germination conditions of the seeds and the response to PEG-8000 treatment， and the effect of different plant growth regulator combinations on Allium victorialis L. adventitious buds induction， Allium victorialis L. seeds of last year and the new one were taken as materials. The seed germination test was carried out with culture dish filter paper. Bulbs of Allium victorialis L. were used as explants for adventitious buds inducted differentiation. The results indicated that the 10% PEG-8000 treatment can obviously promote the germination of old seed. The germination rate was 94.00% and the germination index was 0.89. The germination rate， germination potential and germination index were decreased with the increasing the concentration of PEG-8000. The cold stratification of 50 days and PEG-8000 immersion can significantly promote the germination of the new seeds.The immersion for 4 h with 200 mg·L-1 PEG-8000 after 50 days of sand accumulation layer ， can make the start time and the peak of germination come earlier. The period of germination was reduced by 10 days， compared with CK， germination potential， germination rate and germination index increased by 475.00%， 65.52% and 93.75% respectively， the promotion effect of seed germination was the best. At the same time， PEG-8000 immersion can significantly decreased the number of decomposed seeds after lamination. The formula of MS+6-BA 1.5 mg·L-1+ 2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1 was selected as the optimal medium in the test， and the differentiation rate was 56.56%.

Key words： Allium victorialis L.； Seed germination； PEG-8000； Direct differentiation； Adventitious buds induction

茖葱（Allium victorialis L.）为百合科（Liliaceae）葱属多年生草本植物，别名寒葱、鹿耳葱、隔葱等，全株可供食用，为药食兼用植物，其葱香味浓，并略带爽口野味，为一种珍稀山野菜[1]。近年来，由于其特殊的营养及药用价值日益受到人们的重视[2-4]。茖葱生长环境特殊，供应周期较短，季节性强，繁育能力差，连根挖起的采集方式致使野生茖葱资源遭到严重破坏，数量急剧减少[5-7]。茖葱的实生繁殖较困难，正常条件下茖葱种子发芽慢且所需时间长，具有上胚轴休眠特性。茖葱分株繁殖同样较困难，很难得到大量繁殖体[8]。茖葱产业在我国还比较落后，不能充分有效地保证市场日益扩大的需求。目前我国关于茖葱繁殖的研究报道较少，茖葱种子萌发慢、不整齐的特性仍需进一步改善；另外，组织培养是茖葱进行无性快速繁殖的方法之一。笔者对茖葱种子进行不同生长调节剂配方处理，通过种子发芽试验筛选最优处理方式；通过应用不同培养基配方进行茖葱不定芽诱导，探索茖葱直接分化不定芽诱导的最佳培养基，以期为茖葱的有性、无性繁殖以及规模化的人工驯化栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

茖葱种子采集于吉林农业大学蔬菜试验基地，经吉林农业大学园艺学院宋述尧教授鉴定。发芽试验时间为2016年10月，试验一的种子为2015年采集的陈种子，试验二的种子为当季新种子；不定芽诱导的茖葱材料于2017年4月中旬采自宁夏农林科学院园林场综合试验基地驯化栽培的茖葱全株（2015年10月引自吉林）。

1.2 种子处理

将茖葱种子设置PEG-8000和PEG-8000+层积处理2个试验，种子萌发采用培养皿滤纸卷法进行。

试验一：将茖葱干种子均匀排布于垫有2层无菌滤纸的培养皿居中位置，CK的茖葱种子经去离子水浸泡12 h，滤纸及种子分别用PEG-8000 10%（t1）、20%（t2）、30%（t3）以及去离子水（CK、CK）始终保持湿润，将滤纸两端卷起重叠使成卷状。恒温培养箱培养，温度设定为20 ℃，光照3 000 lx每天照明10 h。

试验二：层积后PEG-8000处理。层积处理以细沙为介质，将细沙用清水反复洗净，在105 ℃下消毒24 h后备用。干种子经0.3% KMnO4溶液浸种消毒15 min，去离子水洗净，种子与湿沙按1∶3的体积比混合，沙子湿度以手握成团、松开不散为宜[9]，装入自封袋，置于4 ℃冰箱中冷藏。冷藏结束后，具体处理见表1，种子萌发方法同试验一的CK。每处理50粒种子，3次重复。

1.3 种子萌发的测定

种子萌发以胚根长达2 mm为标志。种子开始萌发之日起，每5 d观测并记录种子的萌发状况，将已萌发的种子及时取出，播种于已消毒的细沙作介质的育苗盘。连续5 d无种子萌发则视为萌发结束。按李畅等[10]的方法计算发芽启动时间、发芽率（GR）、发芽指数（GI）、发芽势（GE）等。

①发芽启动时间：指从萌发试验开始到第1粒种子开始萌发所持续的时间；

②发芽持续时间：种子开始萌发到最后1粒种子萌发的总时间；

③发芽率（GR）/%=种子发芽总数/供试种子总数×100；

④发芽指数（GI）=∑（Gt·Dt-1），其中Gt为t日内的发芽数，Dt为相应的发芽天数；

⑤发芽势（GE）/%=种子发芽高峰时的发芽种子数/供试种子总数×100；

采用Excel 2003和DPS 7.05对试验数据进行单因素方差分析，采用最小显著差数法（LSD）比较差异显著性。

1.4 不定芽诱导材料处理

用自来水冲去茖葱外植体上的灰尘和泥土，用软毛刷配合洗洁精溶液刷洗外植体表面，除去附着在表面的部分菌体，然后用流水冲洗40 min[8]。在超净工作台上切取鳞茎，放入75%酒精中消毒30 s，然后转入0.1% HgCl2溶液中消毒8 min，再用无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干外植体上的水分，切除与消毒液接触的伤口部位，并将幼嫩鳞茎切成0.5～0.8 cm小段，以备接种。

培养基的配制：以MS培养基为基本培养基，0.7%的琼脂，3%的蔗糖，pH调至5.8，添加生长调节剂，用不同浓度的生长调节剂（6-BA和2，4-D）处理，培养基配方见表4。

采用组培瓶培养，每瓶装30 mL培养基，每瓶接种2块，接种20瓶，3次重复。培养条件：温度23 ℃、湿度65%；光照条件为：首先暗培养14 d，转为光照2 500 lx，光期14 h/暗期10 h。调查不定芽开始分化的时间，30 d后观察并统计不定芽诱导数目及生长情况。

不定芽分化率/%=不定芽诱导数/接种数（除去污染）×100。

参考唐铭[11]的研究结果，茖葱诱导出不定芽30 d 后将不定芽继代培养，60 d 后进行增殖培养，将苗高约1.5 cm的健壮芽苗进行生根培养，最后完成茖葱不定芽分化的再生体系。

2 结果与分析

2.1 种子萌发测定

2.1.1 不同质量分数PEG-8000对茖葱种子发芽情况的影响 从表2可知，CK、t1、t2的發芽启动时间为50 d，CK和t3的发芽启动时间为60 d；CK和t3的发芽持续时间为20 d，t1、t2的发芽持续时间为25 d，CK持续时间最长为30 d；发芽率t1最高为94.00%，t2与t1无显著差异，CK与t2无显著差异，CK最低为72.67%；发芽指数方面，t1最高为0.89，显著高于t2和CK，t2和CK无显著差异，CK和t3的发芽指数较低，且二者无显著差异。由图1可以看出，t2的发芽高峰期在56～65 d，其发芽势为70.00%；61～70 d内，t1的发芽势最高为76.00%；t3和CK的发芽高峰期均在66～75 d内，其发芽势分别为72.00%和66.00%，同时此时间段内t1的发芽势仍然最高，为74.00%。

10%和20%的PEG-8000处理的茖葱种子发芽启动时间早，发芽持续时间较短，发芽率高，而10%的PEG-8000处理发芽势和发芽指数均明显高于20%的PEG-8000处理；去离子水浸泡12 h的茖葱种子发芽启动时间早，但发芽持续时间较长；CK和30%的PEG-8000处理的茖葱种子发芽启动时间晚，发芽持续时间短，但发芽高峰期最晚，发芽率、发芽势及发芽指数均较低。

2.1.2 层积及PEG-8000浸种对茖葱种子发芽情况的影响 表3中T 5发芽启动时间最早，47 d即开始萌发，同时发芽持续时间最短，仅63 d；CK开始萌发的时间最长为50 d；茖葱种子发芽高峰期，除PCK和PT3外，其他处理均在47～55 d内，此时间段内的发芽势PT5最高为92.00%，其次是PT4为80.00%，PT1、PT2、PT3无显著差异，PCK最低为16.00%；PT5 的发芽数最多，发芽率和发芽指数均最高，分别为96.00%和0.93，PT4与PT5无显著差异，其次是PT3 、PT2和PT1，PCK发芽率和发芽指数均最低，分别为58.00%和0.48；PT1的烂种数最多，为6.67粒，PT5的烂种数最少，为1.67粒。

可见，茖葱种子低温层积50 d及PEG-8000浸种能显著促进茖葱种子萌发，使发芽启动时间及发芽高峰期均提前，显著提高了发芽率、发芽势及发芽指数，同时PEG-8000浸种能显著减少种子层积后的烂种数。其中PT5 处理即种子沙藏层积后4℃冰箱保鲜50 d，再用200 mg·L-1 PEG-8000浸种4 h对促进茖葱种子发芽影响最大。

2.2 生长调节剂组合对茖葱不定芽诱导的影响

植物生长调节剂在茖葱直接分化再生体系的过程中至关重要，不定芽的产生与培养基中生长素（2，4-D）和细胞分裂素（6-BA）的比例有关，在二者配合使用的情况下，对茖葱不定芽分化的影响存在较大差异。MS 培养基可使鳞茎直接诱导分化出不定芽，在培养15 d后开始从切口边缘长出浅黄色的芽（图2）。由表4可以看出，2，4-D质量浓度较低时（1.0 mg·L-1），6-BA质量浓度为1.5 mg·L-1时（ST2），芽的诱导和生长情况最优，高于（ST1，2.0 mg·L-1）和低于（ST3，1.0 mg·L-1）此浓度都与其产生显著差异；2，4-D质量浓度较高时（2.0 mg·L-1），仍是6-BA质量浓度为1.5 mg·L-1时（ST4）芽的诱导和生长情况显著优于1.0 mg·L-1（ST5）；但ST2和ST4除开始分化时间无显著差异外，ST2的不定芽分化率（56.56%）和茎芽高（3.86 mm）均显著高于ST4，生长情况也明显优于ST4。可见，ST2的生长调节剂组合，即MS+6-BA 1.5 mg·L-1 +2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1培养基配方不定芽分化快，丛生芽多，生长状况好，分化率高，最适合茖葱不定芽的诱导和生长。

表4 不同生长调节剂组合对茖葱不定芽诱导及生长的影响

[处理 ρ（生长调节剂）/

（mg·L-1） 开始分化

时间/d 不定芽分

化率/% 茎芽

高/mm 生长情况 6-BA 2，4-D KT ST1 2.0 1.0 0.1 18.33 A 9.44 E 1.56 E 细弱（+） ST2 1.5 1.0 0.1 14.67 C 56.56 A 3.86 A 粗壮（++++） ST3 1.0 1.0 0.1 17.67 AB 33.78 C 2.00 C 中等（++） ST4 1.5 2.0 0.1 15.33 C 40.44 B 3.27 B 较粗壮（+++） ST5 1.0 2.0 0.1 18.00 A 18.89 D 1.86 D 细弱（+） ]

[注] 生长情况以“+”表示，“+”越多表示长势越好。

3 讨论与结论

茖葱种子正常条件下发芽慢，所需时间长，种子自然繁殖能力弱。王明焱等[12]研究认为，茖葱种子萌发受温度因子影响较大，建议选择20 ℃为发芽最适温度。张忠宝等[6]的研究結果证明，茖葱种子中存在抑制种子发芽的物质，其抑制物不仅能抑制其他种子的发芽，也对其自身具有抑制作用，其抑制物可能是使茖葱种子长时间休眠的重要原因之一。宋发军等[13]研究不同质量分数的PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000和PEG-10000 对华重楼种子萌发的影响，其中25% PEG-4000 和25% PEG-8000浸种能有效打破华重楼种子休眠并促进种子萌发。张忠宝等[14]的结果为低温层积处理30～45 d和激素处理（GA3 100～150 mg·L-1、NAA 5 mg·L-1）浸种24 h均可显著提高茖葱种子发芽率。在笔者的研究中，前一年的茖葱陈种子不经过其他处理可以正常发芽，但发芽启动时间晚（60 d），持续时间长（80 d），发芽率、发芽势及发芽指数均较低，经去离子水浸种12 h和PEG-8000处理均能促进茖葱种子萌发，浸种能使发芽启动时间提前，随PEG-8000质量分数的增加，茖葱种子的发芽率、发芽势及发芽指数有所降低，其中10%的PEG-8000处理可明显促进茖葱种子发芽；茖葱当年新种子不进行层积处理亦能发芽，但低温层积50 d及PEG-8000浸种能显著促进茖葱种子萌发，使发芽启动时间及发芽高峰期均提前，显著提高了发芽率、发芽势及发芽指数，同时PEG-8000浸种能显著减少种子层积后的烂种数。其中种子沙藏层积后4 ℃冰箱保鲜50 d，再用200 mg·L-1 PEG-8000浸种4 h对促进茖葱种子发芽的效果最好。2个发芽试验中，茖葱种子发芽均较唐铭[11]、王明焱[12]、张忠宝等[13]的持续时间短，发芽高峰期提前。试验同时将已萌发的种子播种于细沙作介质的育苗盘中育苗，所有种子均能正常出苗，且长势无差异。

茖葱不定芽诱导是组培快繁过程中的最重要阶段，笔者筛选出MS+6-BA 1.5 mg·L-1 + 2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1为供试方案中的最优培养基配方。与刘霞等[11]培养基成分为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1（t1）适合不定芽诱导的试验结果略有不同，但理论是一致的，即芽生长情况因6-BA和2，4-D的比值发生变化而变化，当6-BA质量浓度较低时，芽长势细弱纤小，随着6-BA质量浓度上升，长势变强，但到达一定质量浓度后，长势逐渐变弱。本次试验优化了茖葱组织培养不定芽诱导阶段培养基配方，为后续不定芽增殖与生根奠定了基础。

参考文献

[1] 曲继松，宋述尧.茖葱研究进展[J].特产研究，2006（4）：69-72.

[2] 赵怀清，王学娅，难波恒雄.茖葱中含硫化合物对培养心肌细胞的作用[J].药学学报，2000，35（1）：4-6.

[3] KIM Y S，JUNG D H，LEE I S，et al.Effects of Allium victorialis leaf extracts and its single compounds on aldose reductase，advanced glycation end products and TGF-beta1 expression in mesangial cells[J].BMC Complementary and Alternative Medicine，2013，13（3）：838-839.

[4] 李倩竹，赵玉娟，刘乔，等.不同采摘时期长白山野生茗葱功效成分质量分数变化规律分析及降血脂作用研究[J].中山大学学报（自然科学版），2015，54（3）：125-129.

[5] 曲继松.长白山茖葱主要生物学特性研究[D].长春：吉林农业大学，2007.

[6] 张忠宝，刘丽艳，张雷，等.茖葱种子抑制物质的初步研究[J].种子，2012，31（1）：49-52.

[7] CHOI S T，LEE J T，PARK W C.Dormancy physiology，softening culture and evaluation of nutrition value in the Ulrung-native Allium victorialis var.platyphyllum[J].Journal of the Korean Agricultural Chemical Society（Korea Republic），1993，36（6）：495-501.

[8] 劉霞，唐铭，许永华，等. 茖葱不定芽分化的再生体系[J].吉林农业大学学报，2015，37（4）：434-439.

[9] 张忠宝，刘丽艳，许善花. 长白山茖葱生长习性及栽培技术[J].北方园艺，2011（4）：76-77.

[10] 李畅，苏家乐，陈璐，等. 长白山区 6 种杜鹃花属植物种子形态及萌发特性[J].扬州大学学报（农业与生命科学版），2011，32（4）：59-63.

[11] 唐铭.茖葱有性繁殖与无性繁殖的初步研究[D].长春：吉林农业大学，2015.

[12] 王明焱，徐连杰，杨利民. 茗葱种子萌发的生态学特性研究[J].北方园艺，2011（7）：35-37.

[13] 宋发军，余晓东，刘佳，等. 激素和 PEG 对华重楼种子萌发的影响[J].中南民族大学学报（自然科学版），2015，34（2）：14-17.

[14] 张忠宝，刘丽艳，黄城秀，等. 茖葱种子繁殖特性及不同处理对种子发芽的影响[J].北方园艺，2010（3）：32-34.