莫少华 ，刘新权 ，徐春玲 ，张伟 ，程江 ，曹玉文 ，张蕾 *

（1石河子大学医学院，新疆 石河子 832000；2第五师医院，新疆 博乐 833400；3石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832000）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率分别占全世界的12.2%和9.6%[1]。乳腺癌病因及发病机制尚不完全清楚，由于肿瘤细胞表现出的与正常生长的细胞不同的代谢特征，使得肿瘤代谢途径引起国内外广泛关注。目前手术治疗是乳腺癌的主要治疗方式，术后复发和远处转移是影响患者生存率和死亡率的主要因素，因此，研究乳腺癌的发病机制，探索乳腺癌治疗的新手段是减少患者死亡率的重要途径。

研究显示，胱硫醚β-合成酶 (cystathione β synthase，CBS)基因突变可能对肿瘤发生具有潜在的影响[2]。CBS基因第8外显子844位存在68bp的插入突变，该基因发生D到I的突变，产生三种基因型：野生DD型、杂合突变DI型、纯合突变II型，使酶蛋白质空间结构发生改变，导致酶活性改变，引发体内生物学功能发生改变[3]。CBS844ins68突变与乳腺癌的关系结论不一，且存在种族、地域差别。本次研究运用PCR-RFLP技术检测CBS844ins68基因多态性，分析CBS844ins68基因多态性与新疆汉族乳腺癌是否相关。

1 资料与方法

1.1 一般资料

（1）乳腺癌组：选取2016年9月至2017年12月新疆石河子大学医学院第一附属医院和第五师医院住院治疗的乳腺癌女性患者150例，中位数年龄52岁，纳入标准：术前均未行针对乳腺癌的放射和化学治疗，术后均经病理确诊。纳入标准符合最新WHO乳腺癌诊断标准。排除标准：未经手术治疗的乳腺癌患者；同时患两种以上恶性肿瘤患者；既往肿瘤史患者；有乳腺癌家族史的乳腺癌患者。（2）对照组：随机抽取同期来我院的健康女性体检者150例，中位数年龄53岁，纳入标准：无乳腺癌家族史及其他肿瘤病史。排除标准：有乳腺癌家族史及其他肿瘤病史，与同期收集的病例组有生物学关联。所有研究对象均在本地居住5年以上。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集

采集两组研究对象外周静脉抗凝全血6 mL，其中一管EDTAK2抗凝3 mL，用于血液基因组DNA提取，冻存于-80℃。另一管肝素抗凝3 mL，3000 r/min离心10 min，分离血浆检测肿瘤标志物。

1.2.2 电化学发光法检测肿瘤标志物

AFP、CEA、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4 检测按照试剂盒说明书进行，运用罗氏601全自动电化学发光免疫分析仪检测肿瘤标志物。

1.2.3 血液基因组DNA提取

外周静脉抗凝全血3 mL，按照北京天根生化科技有限公司提供的血液基因组DNA提取试剂盒DP304-02(离心柱型)说明提取基因组DNA，测量样本DNA在分光光度计260 nm和280 nm处的光密度(D)值，以评估所提取DNA纯度和浓度并用0.7%琼脂糖凝胶电泳判定DNA的质量。DNA冻存于-80℃。

1.2.4 引物合成

引物序列参考有关文献[4]设计，由上海生工生物有限公司合成。序列为P1：5’-CTGGCCTTGAGCCCTGAA-3’，P2：5’-GGCCGGGCTCTGGACTC-3’。

1.2.5 PCR扩增及电泳判断基因型

PCR反应体系为25 μL，其中DNA模板2.0 μL，上下游引物各 1.0 μL，PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR引物及反应条件为95℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，36个循环，72℃再延伸5 min，PCR反应完成后，取PCR产物 5 μL，在 2%琼脂糖凝胶中，110V，电泳50min，美国伯乐公司Bio-RAD凝胶成像仪成像，检测分析基因型。

1.3 统计学处理

应用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计数资料以频数表示，组间比较采用卡方检验；P﹤0.05为差异有统计学意义，CBS844ins68基因型及其他危险因素与乳腺癌的相关性用Logistic回归分析，结果以相对危险度（OR）和95%可信区间（95%CI）表示。

2 结果

2.1 新疆汉族乳腺癌组和对照组的一般临床资料分析

两组仅是否绝经、CEA、CA15-3的分布差异有统计学意义（P﹤0.05）(表 1)。

表1 乳腺癌组和对照组的一般临床资料分析 n/%Tab.1 General clinical data analysis of breast cancer and control groups n/%

2.2 PCR及基因型鉴定结果

CBS844ins68位点PCR扩增产物目的片段长度为184 bp，经2%琼脂糖凝胶电泳得到两种基因型：野生型（DD型），可见184 bp一个条带；杂合突变型（DI型），可见184bp和252 bp两个条带；纯合子突变型（II型）未检测到(图 1)。

图1 CBS844ins68扩增图Fig.1 CBS844ins68 amplification

2.3 CBS844ins68基因多态性在乳腺癌组和对照组的分布情况

CBS844ins68基因多态性在乳腺癌组和对照组的分布情况由表2可知：

表2 乳腺癌组与对照组CBS844ins68基因型及等位基因分布情况 n/%Tab.2 CBS844ins68 genotype and allele frequency distribution in breast cancer and control groups n/%

乳腺癌组CBS844ins68基因型DD、DI、II分别为94.0%、6.0%、0；对照组 CBS844ins68基因型 DD、DI、II分别为 96.7%、3.3%、0[l8]。乳腺癌组 CBS844 ins68等位基因D、I频率分别为97.0%、3.0%；对照组CBS844ins68等位基因 D、I频率分别为 98.3%、1.7%[19]，两组基因型与等位基因频率分布差异无统计学意义(P＞0.05)（表2）。

2.4 CBS844ins68基因多态性与乳腺癌的多因素分析

以乳腺癌的发生（对照=0，乳腺癌=1）作为因变量，以 CBS844ins68多态性（DD=1，DI=2)、年龄（≥50=0，＜50=1）、绝经（未绝经 =1，绝经 =2）、AFP(＜7=0，≥7=1）、CEA (＜3.4=0，≥3.4=1）、CA125(＜35=0，≥35=1）、CA15-3(＜25=0，≥25=1）、CA19-9(＜27=0，≥27=1）、CA72-4(＜6.9=0，≥6.9=1） 为自变量，采用二分类 Logistic回归模型进行多因素分析，结果显示年龄＜50岁、已绝经、AFP≥7.0、CA15-3≥25、CEA≥3.4可增加新疆汉族乳腺癌发病风险3-9倍（表 3）。

表3 乳腺癌危险因素的 Logistic回归分析Tab.3 Logistic regression analysis of breast cancer risk factors

3 讨论

乳腺癌是复杂的赘生物和肿瘤细胞集合，由来自不同亚型的细胞群组成，在临床表现、病理分型、免疫组化、肿瘤标志物表达水平及预后呈现多样性表达。随着全基因组关联研究的飞速发展，乳腺癌的遗传学发生机制研究在持续深入，流行病学研究显示[5]，遗传因素和环境因素在乳腺癌发病过程中呈现出独特影响作用。基因改变是环境致癌因子致癌作用的一个重要过程。人群中不同的CBS基因型有可能决定不同个体间CBS的表达与功能上的差异，进而影响到体内CBS的最终生物学效应[6]。关于CBS基因多态性的研究较多，但尚无统一结论。目前CBS844ins68基因多态性与新疆乳腺癌相关性研究尚未证实，本研究选取新疆汉族乳腺癌人群为研究对象，首次探讨CBS844ins68多态性与乳腺癌之间的相关性。

CBS位于染色体 21q22.3，长 25～30KB，编码 551个氨基酸。CBS基因中的突变位点有80多个，多数分布在第3和第8外显子中，常见突变位点有844ins68、T833C等。CBS844ins68存在野生型（DD）、杂合突变型（DI）、纯合突变型（II）3种基因型。DD型是CBS基因第8外显子的844位点没有插入68个核苷酸；DI型是一个染色体插入68个核苷酸，另一个染色体没有插入68个核苷酸；II型是两个染色体都插入了68个核苷酸，这种变化是一种基因重排引起的插入突变。由于CBS844插入产生提前出现的终止密码子，导致产生缩短的蛋白质及无功能的CBS酶。该基因发生突变后，其编码的异亮氨酸取代天冬氨酸，引起CBS代谢酶活性降低。研究显示，不同地区不同种族CBS844ins68基因型和基因频率差异很大。钟慧军[7]发现广西宁夏汉族基因型为DD 70.21%、DI 19.86%、II 9.93%，朱文丽[8]研究北京地区人群发现基因型为DD 87.4%、DI 12.6%，陈作森[9]报道山东潍坊汉族人群基因型为DD 99.32%、DI 0.68%，史嘉翊[10]研究黑龙江牡丹江地区409例朝鲜族和汉族人群发现均为DD基因型。Gallegos[11]对墨西哥瓜达哈拉地区323名乳腺癌患者进行研究，发现CBS844ins68 DD和DI基因型突变影响墨西哥乳腺癌人群易感性。英国人群变异的DI基因型频率为20%，哥伦比亚和智利人群DI基因型的频率为10%[12]。人群中68BP插入的纯合突变很少，在日本和印度尼西亚没有观察到CBS 844ins68等位基因突变体[13]。本研究结果显示，新疆汉族乳腺癌组CBS844ins68位点基因型和等位基因频率分别为94.0%、6.0%、0和97.0%、3.0%；对照组基因型频率和等位基因频率分别为96.7%、3.3%、0和98.3%、1.7%，两组基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义(P＞0.05)。这表明CBS基因CBS844ins68位点与新疆汉族乳腺癌发生无相关性。

本次研究发现新疆汉族乳腺癌人群中年龄小于50岁、已绝经、AFP、CEA、CA15-3水平增高是乳腺癌发生的独立危险因素。文献报道，我国乳腺癌高发年龄为40～49岁，西方国家为50～59岁，本次研究发现小于50岁人群乳腺癌发病危险性增高，与Bouchardy研究结果一致[14]。瞿蕾[15]发现是否绝经与乳腺癌的发生具有相关性，绝经晚是乳腺癌发生的危险因素，与本次研究结果有不一致之处，分析原因可能与纳入人群不同、遗传因素及不同地域人群饮食习惯和生活方式不同有关。张同成[16]检测乳腺癌患者肿瘤标志物水平发现AFP显著增高，认为乳腺癌的发生引发体内肿瘤细胞激活AFP基因，AFP水平和肿瘤生物学特性、分化程度密切相关。Shao Y[17]研究显示术前血清CEA和CA15-3水平是影响预后的独立危险因素，CEA和CA15-3明显升高与肿瘤大小、晚期腋窝淋巴结转移密切相关。Wu S G[18]回顾性地分析1148例乳腺癌患者术前的CEA和CA15-3水平，发现术前血清CEA和CA15-3水平升高的患者腋窝淋巴结转移发生率更高，提示CEA和CA15-3可用于预测乳腺癌的预后及腋窝淋巴结转移。

综上所述，本研究发现新疆汉族乳腺癌的危险因素为年龄小于50岁、已绝经、AFP、CEA、CA15-3水平增高的人群，CBS844ins68基因多态性与新疆汉族乳腺癌发生无相关性。由于本研究样本例数较少，实验纳入人群有限，在以后工作和研究过程中会加大样本数，同时进行多地区、多民族、多基因的实验，为临床上治疗乳腺癌提供坚实的理论基础。