张 伟 ， 孙 忻 ， 张 沛 ， 李 莉

(1. 吉林大学动物医学学院 ， 吉林长春130062 ； 2. 天津农学院动物科学与动物医学学院 ，天津西青300384 ； 3. 吉林大学动物科学学院 ， 吉林长春130062)

猪链球菌是一种世界范围内广泛分布的革兰阳性人兽共患致病菌，对养猪业造成了极大的危害，可以引发人和动物包括脑膜炎、链球菌中毒综合征、菌血症在内的多种致死性疾病，严重危害公共卫生安全。猪链球菌根据荚膜抗原不同分为多个血清型，其中猪链球菌2型毒力最强、危害最大。我国分别于1998年和2005年先后两次暴发了猪链球菌病，数百人感染，并出现多起死亡病例，造成了极大的危害和经济损失。目前，临床上主要采用抗生素对猪链球菌感染进行治疗，然而传统抗生素类药物主要以杀灭细菌为目的，给予细菌较强的生存选择压力，容易引发细菌耐药性的产生。随着耐药性猪链球菌的日益增多，使得传统治疗猪链球菌感染的效果逐渐降低，因而，新的抗感染策略以及药物急需被提出。而近些年来，随着分子生物学等学科的快速发展，致病菌的毒力因子在细菌致病过程中所发挥的关键作用也越来越多的引起人们的关注[8]。而猪链球菌携带和分泌的包括溶血素(Suilysin,SLY)、分选酶A、荚膜多糖等在内的多种毒力因子，这些毒力因子与其致病作用有着密切的关系，并且在致病过程中发挥着重要的作用。其中，SLY属于胆固醇依赖家族，一种重要的外分泌毒素。已有研究证明相较于SLY低分泌菌株，SLY高分泌的猪链球菌菌株在感染中具有更强的毒力和侵袭性。而SLY缺失株感染小鼠后可以显著降低感染小鼠的死亡率[11]。此外，Takeuchi等研究发现，SLY在小鼠感染猪链球菌脑膜炎模型中发挥着重要的作用，并且在猪链球菌脑膜炎患者体内分离出的菌株具有SLY高分泌量。进而提示我们SLY可能在猪链球菌通过血脑屏障过程中发挥一定作用。综上，SLY可能是一个治疗猪链球菌感染的潜在作用靶标。

本试验选择 SLY为作用靶点，发现黄芩提取物在不抑制猪链球菌生长的条件下，可显著降低猪链球菌培养物上清的溶血活性，并且分别在体内和体外证明了黄芩提取物对猪链球菌感染具有明显的保护作用，从而进一步充实了黄芩提取物作为治疗猪链球菌感染的先导复合物的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 试验所需黄芩，购自河北金叶子药业有限公司；所选用菌株猪链球菌2型ZY05719由南京农业大学范红结教授惠赠，J774细胞由本实验室保存，雌性C57BL/6J小鼠(6～7周龄)，购自吉林大学实验动物中心。

1.2 黄芩提取物制备 取黄芩20 kg进行粉碎，在水中进行煎煮3次，每次2 h，并将煎液进行合并、浓缩，调节pH值至2.0。80 ℃静置后滤过，沉淀物加水混匀后调节pH值至7.0，加入等体积乙醇进行浸提，反复3次，合并所得滤液，60 ℃条件下进行减压浓缩得到黄芩浸膏。取所得浸膏溶解于二甲基亚砜(DMSO)制备终浓度为10 mg/mL的工作液，4 ℃保存备用。

1.3 黄芩提取物对猪链球菌最小抑菌浓度的测定 采用肉汤微量稀释法(美国临床实验室标准化协会推荐)测定黄芩提取物对猪链球菌ZY05719的最小抑菌浓度。

1.4 猪链球菌生长曲线的测定 将猪链球菌ZY05719振摇培养至OD600 nm值=0.3后，进行平均分装，并在每个等量分装体系内分别加入不同浓度的黄芩提取物，使各体系的终浓度分别达到0、8、16、32 μg/mL和64 μg/mL，之后继续培养，每间隔30 min分别测定各样品在OD600 nm条件下的吸光度值，共计6 h。

1.5 猪链球菌培养物上清的溶血试验 猪链球菌ZY05719振摇培养至对数生长后期，将细菌培养物进行离心，收集培养物上清液，分别取100 μL该培养物上清液加入到875 μL已经加入不同浓度梯度的黄芩提取物的PBS中，37 ℃恒温条件下静置孵育30 min，孵育结束后，各反应体系中分别加入25 μL脱纤维兔血，再次于37 ℃静置培养30 min，完毕后离心收取上清，分别测定各上清的OD540 nm条件下的吸光度值

1.6 活死细胞染色和LDH检测试验 鼠巨噬样细胞J774在含有10%胎牛血清的完全DMEM培养基中培养，用胰蛋白酶进行消化处理后，接种于96孔细胞培养板中，每孔5×104CFU继续培养24 h。将猪链球菌ZY05719振摇培养至OD600 nm值=0.5，离心收集菌体，用PBS洗菌3次后，用完全的DMEM培养基稀释并调整菌液浓度值1×108CFU/mL，之后加入不同浓度的黄芩提取物使得终浓度分别达到0、8、16、32 μg/mL和64 μg/mL，用该药菌混合物感染细胞，在37 ℃、5%CO2条件下共培养5 h后，用LDH检测试剂盒检测细胞上清液乳酸脱氢酶释放量(OD490 nm值)，用Live/Dead 试剂进行细胞染色，采用激光共聚焦显微镜采集图片。

1.7 动物感染试验 将40只雌性C57BL/6J小鼠随机分成2两组，每组20只，分别腹腔注射感染200 μL猪链球菌ZY05719(1×109CFU/mL)，其中给药组按100 mg/kg·bw，皮下给予黄芩培养物，对照组给予DMSO。连续观察96 h，统计死亡率。

1.8 数据统计分析 试验数据统计以平均值±标准差表示并采用SPSS 13.0统计软件对组间数据进行了双尾显著性检验分析，其中P<0.05被视为差异显著，用*表示；P<0.01视为差异极显著，用**表示。

2 结果

2.1 黄芩提取物不具有抗菌活性 本试验通过最小抑菌浓度(MIC)和生长曲线的测定来观测黄芩提取物对猪链球菌的抗菌活性。结果表明，黄芩提取物对猪链球菌ZY05719的MIC浓度大于1 024 μg/mL，并且通过生长曲线的绘制发现，试验所选黄芩提取物的浓度几乎不影响猪链球菌ZY05719的生长(图1)，综上研究发现，黄芩提取物无抗菌活性。

图1 在不同黄芩提取物浓度的作用下猪链球菌的生长曲线

2.2 黄芩提取物可以抑制猪链球菌培养物上清溶血活性 SLY属于胆固醇依赖家族，具有红细胞裂解活性，通过这一表型特征，我们通过溶血试验研究发现，黄芩提取物可以显著抑制猪链球菌培养物上清的溶血活性，相比较于未加入黄芩提取物的对照组，黄芩提取物为32 μg/mL、 64 μg/mL的猪链球菌培养物上清的溶血活性均发生极显著的下降(图2)，并且这种溶血活性的抑制作用呈现明显的浓度依赖性。

图2 黄芩提取物对猪链球菌菌液上清溶血作用的抑制作用

2.3 黄芩提取物可以降低猪链球菌感染所造成的宿主细胞死亡 在体外研究黄芩提取物在猪链球菌感染过程中的保护作用，我们通过活死细胞染色试验和LDH检测分别进行了定性和定量分析。在活死细胞染色试验中，损伤的死细胞被染料染成红色，而活细胞被染成绿色，如中插彩版图3a所示，细胞与猪链球菌共培养后，感染细胞发生了明显的死亡，大面积呈现红色染色。而加入黄芩提取物治疗组感染细胞的死亡明显减少，细胞状态也有所好转，如中插彩版图3b所示，黄芩提取物明显降低了感染细胞的死亡。此外，黄芩提取物本身对细胞无毒性(中插彩版图3c)。并且，我们进一步通过检测细胞上清液内LDH的释放量，定量说明了黄芩提取物可以有效地缓解猪链球菌感染所造成的细胞损伤(中插彩版图3d)，当黄芩培养物浓达到64 μg/mL时，相较于对照组，感染细胞的死亡率由39.87%下降至7.89%。

2.4 黄芩提取物可以延缓感染猪链球菌小鼠的死亡 我们通过对感染猪链球菌的小鼠给予黄芩提取进行治疗，小鼠感染猪链球菌后精神沉郁，被毛凌乱，发生了明显的死亡，感染96 h后，感染小鼠除1只外其余全部死亡。而给予黄芩提取物进行治疗的小鼠，精神状态有所改善，虽然感染后也发生死亡，但相比对照组明显被延缓，感染96 h后，仍有5只存活(图4)。

图4 黄芩提取物对猪链球菌感染小鼠存活率的影响

3 讨论

猪链球菌感染一直以来都是公共卫生安全和养猪的一个巨大威胁，对猪链球菌感染的有效治疗也是一个困扰着人们的难题。目前，临床上主要采用抗生素来治疗猪链球菌感染。抗生素在人类和病原菌斗争的过程中做出过不可磨灭的贡献，一度成为人类治疗细菌性疾病和养殖业的健康的发展的重要依仗，然而抗生素多是以杀灭细菌为主要目的，给予细菌极大的生存选择压力，因而极易诱发细菌产生耐药性。当下细菌耐药性的问题日益严重，而新型抗生素的研发速度远远低于细菌耐药性的产生的速度，新型抗感染策略和机制药物迫切需要被提出[13]。同样，临床上已经分离出多种针对各种抗生素产生耐药性的猪链球菌菌株，猪链球菌的耐药性问题日益严峻[14]。毒力因子在细菌致病过程中发挥重要作用，与传统抗生素作用机制不同，抗毒力策略选择作用毒力因子不会给细菌造成生存压力，因而可以减缓细菌耐药性的产生，近年来相关方面的研究也越来越多的得到人们的认可。而猪链球菌所产生的毒力因子SLY在感染过程发挥着重要的作用，敲除后其毒力显著降低[11]，因而选择抑制SLY可能会治疗猪链球菌感染中发挥重要作用。

本试验发现，在不影响猪链球菌正常生长的条件下，黄芩提取物可以显著抑制猪链球菌上清的溶血活性，因而提示该提取物不会给细菌较大生存选择压力，并可以有效降低其分泌的溶血素的生物活性作用，是一种符合抗毒力策略的潜在治疗猪链球菌感染的先导复合物。我们通过在体外和体内研究黄芩提取物对猪链球菌感染的作用，进一步证明了黄芩提取在体外可以有效地保护猪链球菌感染细胞的死亡，明显的抑制了SLY多介导的细胞毒性。并且，体内研究也发现黄芩提取物可以延缓感染小鼠的死亡，并降低感染小鼠的死亡率。综上表明，黄芩提取物是一种通过靶向SLY而在猪链球菌感染中发挥治疗作用的先导复合物。