施河丽，向必坤，谭军，彭五星，孙玉晓，王瑞，吴文昊，魏国胜，丁才夫

湖北省烟草公司恩施州公司，湖北恩施 445000

近年来，根际微生态系统引起了人们的广泛关注。根际（rhizosphere）是指受植物根系活动的影响，在物理、化学和生物学性质上不同于土体的微域土区[1]。在根际这一微域环境内，植物、土壤和微生物三者相互作用形成独特的微生态环境。微生物是土壤微生态系统最重要的组成部分，在土壤营养循环、有机质分解、土壤肥力保持和提高、污染物降解、能量流动以及作物土传病害的防治等方面起着重要作用[2-4]。微生物相比土壤微生态系统中的其他成分，对土壤环境的变化更为敏感[5]。

烟草青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的土传细菌性病害，严重危害烟株生长，造成巨大的经济损失，是毁灭性的病害。研究表明，土传病害的发生与根际土壤微生物的数量、区系和群落结构关系密切[6-7]，是根际土壤微生物群体相互作用的结果。土壤微生物群体可在一定程度上抑制作物的土传病害，微生物群落结构越丰富，多样性越高，对抗病原菌的综合能力越强[8]。通过调节烟草根际土壤微生态环境来抑制土传病害的发生已成为研究的热点，本文从烟草根际土壤微生态角度出发，采用宏基因组学高通量测序技术，比较发病烟株和健康烟株根际土壤细菌群落结构的差异，明确根际土壤细菌群落与土壤环境因子间的关系，为从根际土壤微生态调控方面研究烟草青枯病的防控问题奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于湖北省恩施土家族苗族自治州咸丰县朝阳寺镇鸡鸣坝烟区，北纬 29°37′，东经 108°57′，海拔670 m。土壤类型为黄棕壤，土壤质地为壤土。选取土壤肥力中等、地势平坦、排灌方便、常年种植烤烟、多年不发生青枯病和青枯病发病严重的烟田各5块。在烟株旺长后期，同时也是青枯病发病高峰期，最终确定不发生青枯病和发病率为95%以上的烟田各3块，健康烟田编号为HRS1～HRS3，发病烟田编号为DRS1～DRS3。供试烤烟品种为K326。供试土壤基础理化性质如表1所示。

表1 供试土壤基本理化性质Tab.1 Basic chemical and physical properties of the tested soil

1.2 根际土壤样品的采集与处理

采样时间为青枯病发病高峰期（2016年7月28日），采用多点取样法，每块烟田选取8株烟采集根际土壤。用采样铲将烟株根系完整挖出，轻敲根系，使与根系结合较松的土壤自然落下后，将与根系紧密结合的土壤连同根系放入自封式取样袋中，用手轻轻揉捏抖动根系，使与根系结合较紧密的土壤（4 mm内）落入取样袋中，所采样品即为根际土壤。将每块烟田8株烟的根际土壤混合后作为一个样品，最终得到6个根际土壤样品。将所采集的根际土壤样品分为两份，一份置于冷藏箱中带回实验室，于-20℃冰箱中保存，用于提取土壤微生物基因组DNA；另一份根据测定指标将土样风干研磨后过不同孔径的筛，用于测定土壤化学性质。

1.3 根际土壤微生物DNA的提取

根际土壤微生物基因组总DNA采用Fast DNA®SPIN Kit for Soil（Qbiogene，Inc.USA）试剂盒提取。各样品DNA提取物存于-20℃备用。

1.4 根际土壤细菌DNA的扩增和测序文库的建立

扩增细菌16S rRNA的V3-V4 可变区，采用正向引 物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')， 反向引物806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3')。PCR反应体系：土壤微生物DNA模板（10 ng/μL）2.5 μL，Forward 引物和 Reverse引物（1 μmol/L）各5 μL，KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5 μL。PCR反应条件： 95℃ 3 min ；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，25个循环；72°C延伸5 min。PCR产物经纯化、质检建立测序文库，再对文库进行文库纯化、质检后，送上海伯豪生物技术有限公司，采用MiSeq sequencer (Illumina)进行测序。

1.5 OTU聚类

采用 Mothur (http://www.mothur.org/)软件将测序序列去重复，与已知数据库GreenGene、Silva等比对，去除嵌合体序列和线粒体、叶绿体序列。计算其距离，并在97%的相似水平下进行OTU聚类。

1.6 根际土壤化学性质测定

采用常规方法测定根际土壤化学性质。用pH计法（土：水=1:2.5）测定pH；用重铬酸钾容量法测定有机质；用扩散法测定碱解氮；用硫酸钼锑抗比色法测定有效磷；用火焰光度法测定速效钾；用乙酸铵浸提-原子吸收分光光度法测定土壤交换性钙、钠和镁[9]；采用原子吸收法测定有效铁、锰、铜和锌；用沸水浸提-姜黄素比色法测定有效硼[10]。

1.7 数据处理

随机选取相似度在97%条件下的OTU，利用mothur软件做rarefaction分析，利用perl语言工具绘制稀释曲线图。利用Mothur软件计算Chao指数、ACE指数、Shannon 指数和Simpson指数等4种常用的多样性指数，测序深度用覆盖率（Coverage）表示。将部分属的分类信息进行聚类，利用HemI软件绘制heatmap图。利用Excel 2007进行初处理和制图，采用SPSS 22.0软件进行统计分析。利用R语言的VEGAN数据包对根际土壤细菌群落结构与土壤环境因子进行典范对应分析（Canonical Correspondence Analysis）。利用SPSS 22.0软件进行根际土壤细菌群落结构多样性和丰度与土壤环境因子的Spearman相关性分析。

2 结果与分析

2.1 根际土壤测序深度评估

随机抽取测序序列，将抽到的序列数与他们所代表OTU的数目构建曲线，在97%相似性水平下聚类OTU并制作各样品的稀释性曲线。从本研究数据构建的稀释性曲线来看（图1），在测序量增加的初始阶段，OTU数量呈急剧上升趋势，随着测序量的不断增加，OTU数量的增加基本趋向于平缓，但仍有上升趋势，表明测序数量基本合理，可以初步反映根际土壤样品中的细菌种群构成，但尚有部分微生物未被发现。

图1 根际土壤样品细菌多样品稀释性曲线Fig.1 Bacterial rarefaction curves of different rhizosphere soil samples

2.2 根际土壤细菌Alpha多样性分析

由表2可知，发病烟株根际土壤细菌OTU数为4045，健康烟株根际土壤细菌OTU数为4540，健康烟株根际土壤细菌OTU数比发病烟株高12.24%。97%相似度覆盖率为93.38%～93.84%，表明该数据足以解释根际土壤细菌的多样性，可反映出真实环境中细菌群落结构，具有研究意义和实际价值。Ace指数和Chao指数可以反映群落物种丰富度，其值越大表明群落物种的丰富度越高。Shannon指数和 Simpson指数可以反映群落物种多样性，其中Shannon指数值越大，群落多样性越高；而Simpson指数值越小，群落多样性越高[11-12]。本研究表明，健康烟株根际土壤细菌Ace指数、Chao指数和Shannon指数有高于发病烟株的趋势，而Simpson指数有低于发病烟株的趋势。

2.3 基于分类地位的群落特征分析

2.3.1 门水平的细菌群落组成

从烟草根际土壤中主要检测出26个门类的微生物，相对丰度在1%以上的有10个门类，其中变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）为根际土壤的3大优势菌门，在发病烟株的根际土壤中共占细菌总群落的70.41%，在健康烟株根际土壤中共占细菌总群落的67.90%（图2）。对发病烟株和健康烟株根际土壤细菌进行门水平的比较发现，疣微菌门（Verrucomicrobia）在健康烟株根际土壤中的丰度是其在发病烟株中的2.28倍；酸杆菌门（Acidobacteria）、 绿 弯 菌 门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和浮霉菌门（Planctomycetes）在健康烟株根际土壤中的丰度比其在发病烟株中分别高31.67%、2.48%、13.29%和49.36%；另外，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和Candidatus_Saccharibacteria在发病烟株根际土壤中的丰度比其在健康烟株中分别高16.82%、4.85%、16.88%、27.56%和73.78%。

表2 根际土壤细菌Alpha多样性统计Tab.2 Statistical analysis of bacterial Alpha diversity in rhizosphere soil

图2 发病烟株和健康烟株根际土壤细菌群落在门水平上的组成Fig.2 Composition at the phylum level of the bacterial community in the rhizosphere soil of disease infected plant and healthy plant

2.3.2 属水平的细菌类群组成

从属的角度进行heatmap图谱分析发现（图3），Gaiella、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和芽单胞菌属（Gemmatimonas）为根际土壤中的优势菌属；芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和链霉菌属（Streptomyces）等益生菌在健康烟株根际土壤中的丰度有高于发病烟株的趋势；而劳尔氏菌属（Ralstonia）和Rudaea等病原菌的丰度有低于发病烟株的趋势。

图3 根际土壤样品细菌OTUs热图Fig.3 Heatmap of the bacterial OTUs in the rhizosphere soil samples

将发病烟株和健康烟株根际土壤中丰度超过0.5%的27个属进行对比分析发现（图4），有13个属在健康烟株根际土壤中的丰度较高，包括水球菌属（Aquisphaera）、芽孢杆菌属（Bacillus）、康奈斯氏杆菌属（Conexibacter）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、沉积岩杆菌属（Ilumatobacter）、两面神菌属（Janibacter）、Kofleria、类诺卡氏属 (Nocardioides)、 红游动菌属（Rhodoplanes）、土壤红杆菌属（Solirubrobacter）、鞘脂菌属（Sphingobium）、链霉菌属（Streptomyces）和栖热嗜油菌属（Thermoleophilum），其中土壤红杆菌属（Solirubrobacter）和鞘脂菌属（Sphingobium）在健康烟株根际土壤中的丰度是其在发病烟株中的4倍以上，鞘脂菌属（Sphingobium）和栖热嗜油菌属（Thermoleophilum）的丰度显著高于发病烟株。有14个属在发病烟株根际土壤中的丰度较高，包括酸土单胞菌属（Aciditerrimonas）、节杆菌属(Arthrobacter)、慢生根瘤菌属（Bradyrizobium）、伯克氏菌（Burkholderia）、Gaiella、北里维菌属（Kitasatospora）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、Pseudolabrys、劳尔氏菌属（Ralstonia）、根瘤菌属（Rhizobium）、产黄杆菌属（Rhodanobacter）、Rudaea、 鞘 氨 醇 单 胞 菌 属（Sphingomonas）、Thermosporothrix，其中劳尔氏菌属（Ralstonia）和Rudaea在发病烟株根际土壤中的相对丰度是其在健康烟株中的3.3倍和2.3倍，慢生根瘤菌属（Bradyrizobium）的丰度显著高于健康烟株。

图4 发病烟株和健康烟株根际土壤优势细菌属比较Fig.4 Relative abundance of the most abundant genus in the rhizosphere soil

2.4 根际土壤细菌群落结构与土壤环境因子的关系

2.4.1 根际土壤化学性质

由表3可知，健康烟株根际土壤的pH值比发病烟株根际土壤高0.71个单位，且差异达到显著水平。健康烟株根际土壤的有机质、有效磷、交换性钙、交换性镁、交换性钠、有效铜和有效锌含量有高于发病烟株的趋势，其中有效磷、交换性钙和有效铜3个指标显著高于发病烟株。健康烟株根际土壤的碱解氮、速效钾、有效铁、有效锰和有效硼含量有低于发病烟株的趋势，且速效钾指标显著低于发病烟株。

表3 发病烟株和健康烟株根际土壤的化学性质Tab.3 Chemical properties in disease infected plant and healthy plant rhizosphere soil

2.4.2 典范对应分析

为分析根际土壤细菌群落结构与土壤化学性质的关系，以细菌群落在门水平上的丰度数据作为物种数据，发病烟株和健康烟株根际土壤差异显著的化学性质数据作为土壤环境变量，通过R语言的VEGAN数据包进行典范对应分析（CCA）（图5）。前两个排序轴总共解释了64.55%的细菌群落变化，第一排序轴（CCA1）解释了38.73%，第二排序轴（CCA2）解释了25.82%，其中第一排序轴（CCA1）对土壤细菌群落变化解释最多。发病烟株和健康烟株根际土壤彼此分离，健康烟株根际土壤样品主要分布在纵坐标轴的左侧，发病烟株根际土壤样品主要分布在纵坐标轴的右侧。土壤pH和交换性钙（Ca）与横坐标负轴夹角较小，表明这两个指标与CCA1相关性较高；速效钾（AK）与纵坐标正轴夹角较小，有效磷（AP）和有效铜（Cu）与纵坐标负轴夹角较小，表明这3个指标与CCA2相关性较高。同时，从图中箭头的分布可以看出，pH、AP、Ca和Cu这4个指标与健康烟株根际土壤细菌群落存在较强的正相关性。

图5 根际土壤细菌群落结构与化学性质的CCA分析Fig.5 Canonical Correspondence Analysis of the relationship between rhizosphere soil bacterial community structure and chemical properities

2.4.3 根际土壤细菌群落与土壤环境因子的Spearman相关性分析

对发病烟株和健康烟株根际土壤多样性指数和差异显著属丰度与土壤环境因子进行Spearman相关性分析发现（表4），在发病烟株根际土壤细菌群落中，Ace指数和Chao指数与土壤Cu含量显著正相关；Shannon指数与土壤AK和与Ca含量显著负相关； Simpson指数与土壤AK和Ca含量显著正相关；慢生根瘤菌属（Bradyrizobium）的丰度与土壤pH显著负相关，而与土壤AP含量显著正相关；鞘脂菌属（Sphingobium）的丰度与土壤pH显著正相关，而与土壤AP含量显著负相关；栖热嗜油菌属（Thermoleophilum）的丰度与土壤Cu含量显著负相关。由此可知，发病烟株根际土壤细菌群落结构与土壤环境因子pH、AP、AK、Ca和Cu显著相关。

在健康烟株根际土壤细菌群落中，Ace指数与土壤Ca含量显著负相关；Chao指数与土壤Cu含量显著正相关；Shannon指数与土壤AP含量显著正相关，而与土壤AK含量显著负相关；Simpson指数与土壤Ca含量显著正相关；慢生根瘤菌属（Bradyrizobium）的丰度与土壤AP含量显著负相关，而与土壤AK含量显著正相关；鞘脂菌属（Sphingobium）的丰度与土壤Ca含量显著正相关；栖热嗜油菌属（Thermoleophilum）的丰度与土壤Cu含量显著负相关。由此可知，健康烟株根际土壤细菌群落结构与土壤环境因子AP、AK、Ca和Cu显著相关。

表4 根际土壤细菌群落与土壤环境因子的Spearman相关性分析Tab.4 Spearman correlation analysis of rhizosphere soil bacterial community with soil environment factor

3 讨论

（1）生态系统中物种多样性指数反映了种群结构的复杂程度。一般来说，多样性指数较高，系统的结构也较复杂，稳定性相对较高[13]。本研究中用丰富度指数和多样性指数分析根际土壤细菌Alpha多样性，结果表明，健康烟株根际土壤细菌Ace指数、Chao指数和Shannon指数有高于发病烟株的趋势，这与前人的研究结果一致[14-15]，而Simpson指数有低于发病烟株的趋势。说明健康烟株根际土壤细菌多样性水平较高，群落结构优于发病烟株。已有研究表明，土壤微生物多样性对维持土壤健康和抑制植物病害非常重要，微生物多样性的降低是土传病害发生的重要原因。

（2）根据根际土壤细菌16S rDNA测序结果可以看出，发病烟株和健康烟株根际土壤之间的细菌门类和属类组成基本相似，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）是根际土壤中的优势菌门，这与前人的研究结果一致[16-17]；Gaiella、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和芽单胞菌属（Gemmatimonas）是根际土壤中的优势菌属。有多个细菌属在发病烟株和健康烟株根际土壤之间存在显著差异，栖热嗜油菌属 （Thermoleophilum）和鞘脂菌属（Sphingobium）在健康烟株根际土壤中占据显著优势，而慢生根瘤菌属（Bradyrizobium）在发病烟株根际土壤中占据显著优势。栖热嗜油菌属（Thermoleophilum）为高效嗜热微生物，在油类的降解[18]方面有一定的作用；鞘脂菌属（Sphingobium）对取代脲类除草剂[19-20]和有机氯农药[21]具有优良的降解能力，在除草剂和农药污染土壤的修复中具有重要作用；慢生根瘤菌属（Bradyrizobium）有固氮作用，能将分子N2转化为NH3[22]，固氮微生物在氮素缺乏的土壤中更具竞争优势，土壤氮素含量的变化会影响固氮微生物与其它土壤微生物的竞争关系，从而影响固氮微生物的群落组成[23]；这三类细菌与青枯病的关系还有待更深一步的研究。根际微生物种群与植物的健康状况也有着密切关系[24]。目前，已经报道的用于防治青枯病的益生菌主要包括芽孢杆菌属（Bacillus）[25]、假单胞菌属（Pseudomonas）[26]和链霉菌属（Streptomyces）[27-28]等。在本研究中，芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和链霉菌属（Streptomyces）等益生菌在健康烟株根际土壤中的丰度比其在发病烟株中分别高43.31%、1倍和56.47%；劳尔氏菌属（Ralstonia）和Rudaea等病原菌在发病烟株根际土壤中的丰度是其在健康烟株中的2-3倍，烟草青枯病病原菌青枯雷尔氏菌就属于劳尔氏菌属。结果表明，由于青枯病的发生，根际土壤细菌群落中益生菌减少、病原菌增加，根际微生态细菌群落的功能受到破坏。

（3）土壤化学性质分析结果显示，健康烟株根际土壤pH、AP、Ca和Cu含量显著高于发病烟株，而AK含量显著低于发病烟株。由此可见，发病烟株根际土壤pH较低，肥力状况较差且营养元素，尤其是P、Ca、Cu元素缺失严重。土壤的微生态与土壤某些化学性质紧密相关。CCA分析结果表明，土壤pH、AP、AK、Ca和Cu对根际土壤细菌群落有较大的影响，且健康烟株根际土壤细菌群落与pH、AP、Ca和Cu存在较强的正相关性。Spearman相关性分析发现，土壤pH、AP、AK、Ca和Cu含量是影响发病烟株根际土壤细菌群落结构的关键土壤环境因子；土壤AP、AK、Ca和Cu含量是影响健康烟株根际土壤细菌群落结构的关键土壤环境因子。本研究从多种角度分析表明，土壤pH、AP、AK、Ca和Cu是影响青枯病发生的重要土壤环境因子。土壤酸化是导致青枯病发生的重要原因[29]，因此土壤调酸是控制青枯病发生的重要手段。P、K、Ca、Cu都是植物生长发育过程中必不可少的矿质营养元素，除了影响烟株正常的生长发育外，还能够影响植物的抗病性。Wang等[30]的研究表明在健康土壤中的速效钾含量显著高于青枯病感染的土壤，而本研究的结果却与之相反，出现这种情况的原因以及K元素与青枯病发生的关系还有待于进一步探讨。已经证明有多种植物病害与钙素含量密切相关，Jiang[31]等研究指出，在一定范围内，增加钙浓度可以提高番茄植株的过氧化物酶活性，对番茄青枯病的控病效果也越好；He[32]等研究发现通过提高土壤中钙离子浓度能够延缓和降低烟草青枯病发生。铜素是植物体内多种蛋白质和酶的组成成分，直接参与酚类代谢，提高植物抗病力，李鑫[33]等的研究表明铜元素具有诱导抗病性、增强烟草对PVYN侵染的抵抗能力。根际土壤细菌群落与土壤环境因子互作影响青枯病的发生，这种互作关系和作用机制值得进一步深入研究，进而为有效防控青枯病提供新的线索。

4 结论

健康烟株根际土壤表现出更高的细菌多样性，群落结构优于发病烟株根际土壤；发病烟株根际土壤中芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和链霉菌属（Streptomyces）等益生菌减少，而劳尔氏菌属（Ralstonia）和Rudaea等病原菌增加；发病烟株根际土壤pH较低，肥力状况较差且营养元素，尤其是P、Ca、Cu元素缺失严重；土壤 pH、AP、AK、Ca和Cu是影响发病烟株根际土壤细菌群落结构的重要土壤环境因子。