欧阳石，陈小平，程涛，钟宋，刘崇文，肖露露，陈阳述

HBV感染呈世界性流行，但不同地区HBV感染的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中2.4亿人为慢性HBV感染者，每年约有65万人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌（HCC）[1]。在全球肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分别为30%和45%[2]。在我国肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分别为60%和80%[3]。2006年全国乙型肝炎血清流行病学调查表明，1～59岁一般人群HBsAg携带率为7.18%[4-6]。据此推算，我国有慢性HBV 感染者约9300万人[7-9]。由于乙肝疫苗接种的普及，HBV感染明显减少。台北的一项研究对8733名在1987年7月后出生的高中生进行检测，发现HBsAg阳性率为1.9%，同时抗HBs阳性率仅为48.3%，提示有相当部分完成免疫接种者仍会丧失对HBsAg的免疫记忆[10]。遗传易感性是HCC发生的主要危险因素之一，在乙型肝炎发展为HCC的过程中起着关键性的作用[11]。人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）最显著的特征是具有明显的多态性，其多态性的差异决定免疫反应的不同。由于不同个体HLA等位基因的差异，表达不同的HLA抗原，对同一抗原的免疫应答强度也不同，进而导致疾病转归不同。因此，携带不同HLA基因个体对HBV感染的易感性、发展为慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）和HCC发生均存在个体差异[11]。有关HLA基因多态性与HCC发生相关性的研究已经有一些报道，由于这些研究所选择的人种和地域不同，得出的结论也存在差异。本研究采用聚合酶链反应-直接测序分型（polymerase chain reaction sequence-based typing，PCR-SBT）法对广东地区HCC患者血HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1基因多态性进行了分析，为从基因水平研究免疫遗传因素在汉族人群HCC发病机制中的作用提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2012年6月～2015年12月 就诊于解放军第458医院的广州地区HBV感染后罹患HCC患者56例，男性53例，女性3例；年龄（51.38±10.21）岁。符合中华医学会制定的原发性肝癌诊疗规范标准[12]，排除合并HCV或/和HIV感染者。另选在深圳血库义务献血的健康志愿捐献者97例，男性86例，女性11例；年龄（49.71±12.34）岁，两组间年龄和性别均无统计学差异（P＞0.05）。

1.2 血清学检测 采用ELISA法检测HBsAg（北京万泰生物药业有限公司）；采用PCR法检测HBV DNA（Light Cycler@480荧光定量 PCR仪和LightCycl er@480 SYBRGreen I Master试剂盒）。

1.3 血液HLA基因分型 抽取静脉血，采用EDTA抗凝，抽取0.3 mL，使用Gentra DNA提取试剂（美国，Gentra）抽提DNA。采用 SBT法（美国Ariza公司试剂盒，即Atra Genetics AlleleSEQR HLA-A，-B、-C、-DQB1、-DRB1 SBT）分别扩增 HLA-A、B 等位基因第2、3和4外显子、HLA-C和-DQB1基因第2和第3外显子、HLA-DRB1基因第2外显子，纯化产物后，进行测序反应，使用ABI3730型序列分析仪进行毛细管电泳。应用Assign version 3.5版（Conexio Genomics，AppIecross，澳大利亚）软件分析测序图谱。

1.4 统计学方法 应用Arlequin统计软件分析基因频率，计算研究对象各检测位点等位基因和基因型频率，并验证是否符合Hardy-Weinberg平衡，此处以P＜0.05作为Hardy-Weinberg不平衡的标准。应用Pearson卡方检验或连续校正卡方检验或Fisher精确概率法计算两组人群基因频率差异，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC患者与健康人血HLA-A等位基因的情况 HCC患者血HLA-A*02:03和A*02:07等位基因频率明显高于健康人（x2=5.167、x2=10.33，P=0.023、P=0.001）；HCC 患者血 HLA-A*30:01等 位基因频率0.017857明显低于健康人（x2=5.355，P=0.021，表 1）。

2.2 HCC患者与健康人血HLA-B等位基因频率比较 HCC患者HLA-B*46:01等位基因频率明显高于健康人（x2=5.439，P=0.02）；HCC 患者 HLAB*13:02等位基因频率明显低于健康人（x2=6.702，P=0.01，表 2）。

2.3 HCC患者和健康人HLA-C等位基因频率分析 两组之间未见有明显统计学差异的等位基因频率，见表3。

2.4 HCC患者和健康人血HLA-DRB1等位基因频率分析 HCC患者血HLA-DRB1*14:54等位基因频率明显高于健康人（x2=14.502，P=0.000）；HCC 患者血HLA-DRB1*12:02等位基因频率明显高于健康人（x2=4.761，P=0.029，表 4）。

2.5 HCC患者和健康人血HLA～DQB1等位基因频率分析 HCC患者血HLA-DQB1*05:03等位基因频率明显高于健康人（x2=4.951，P=0.026，表 5）。

表1 HCC患者与健康人血HLA-A等位基因频率比较

表2 HCC患者和健康人HLA-B等位基因频数比较

表2 -续表

表3 HCC患者和健康人血HLA-C等位基因频数比较

表3 -续表

表4 HCC患者与正常人血HLA-DRB1等位基因频数比较

表5 HCC患者与正常人血HLA-DQB1等位基因频数比较

3 讨论

SBT技术无论在分型精确度、工作效率和自动化程度方面都明显优于其它分型方法。在本研究中，我们采用SBT法首次对中国广东地区HCC患者血 HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1 高分辨等位基因进行了分型。

HLA基因复合体是迄今所知的人类最具有多态性的基因系统，依据编码分子的不同特性而分成3类基因区，分别称为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类基因。研究表明，肿瘤发生与机体免疫监控失调有关，HLA I类抗原与肿瘤的发生发展关系密切。经典的HLA I类分子包括HLA-A、B、C，几乎分布于所有的有核细胞表面，是CD8+T淋巴细胞识别标志之一。HLA I类分子具有重要的免疫生物学功能：一方面HLA I类分子直接参与抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）对内源性抗原的加工和处理；另一方面，在T细胞抗原识别受体（T cell receptor，TCR）特异性识别APC递呈的抗原肽过程中，必须同时识别抗原肽以及与抗原肽结合成复合物的HLA分子，才能产生激活T细胞的信号。HLA复合体通过参与抗原递呈、制约免疫细胞间的相互作用、控制机体免疫应答的发生及强度等多个方面，参与免疫调节。尽管有在HCC组织和体外培养细胞中HLAⅠ类抗原表达增多的报道[13]，有关HLAⅠ等位基因与HCC发生的关系的研究报道非常少。Pan N et al在南京对中国东南地区人群的研究显示[14]：A/11:01:01G、B/35:01:01G、B/58:01:01G和 C/03:02:01G是 HCC发生的易感基因，且B/35:01:01G显示出12.04倍的HCC发生风险，与本研究发现并不一致。我们发现HLA-A*02:03、A*02:07、HLA-B*46:01 三个HLA-Ⅰ类等位基因在HCC人群表达远高于正常健康人，提示 HLA-A*02:03、A*02:07、HLA-B*46:01 可能为HBV感染后罹患HCC的易感基因，这种差异可能与地区间的人群差异有关。

HLA II类基因的等位基因多态性导致了抗原结合槽及提呈抗原肽给T细胞的效率不同而决定着不同个体对免疫应答的差异。在II类区域中又以HLA-DRB1等位基因多态性最复杂，且是机体免疫基因（Ir）所在区域，故与免疫应答关系最为密切，并与许多疾病的遗传易感性[15-19]相关。迄今，HLA II类等位基因与HCC病理以及遗传易感性的关系已有较多阐明，本研究显示，DRB1*14:54在HCC人群表达远高于正常健康人，与之前的研究结果相符[20-22]，提示其为HBV感染后罹患HCC的易感基因，是乙型肝炎患者发展为HCC的危险因素，而DRB1*12:02在HCC人群的表达显著高于正常对照，与Lin的研究也是符合的，可能是HCC的保护性因素。