尹 蕾， 王伟舵， 陈子璇， 贲爱玲， 吴雨龙， 黄 和

(1.南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京 211816； 2.南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京 211171)

相关统计表明，全球每年约产出20亿t的农作物秸秆，而我国产秸秆数量高达9亿t，占全世界范围内秸秆产量的20%～30%[1]。水稻秸秆主要是由纤维素、半纤维素、木质素、粗蛋白、低分子碳水化合物及无机盐等构成的[2]。秸秆中含有多种化学微量元素，其中硅是含量最多的矿物元素[3]。水稻秸秆中纤维素和半纤维素含量相当，均在30%左右，两者是维持水稻秸秆形态结构的主要物质，木质素含量较低，仅为4%，粗蛋白、结构蛋白含量分别为5%、4%，硅化物含量为9%[4]。细菌、真菌、放线菌主要负责分解秸秆中的纤维素与半纤维素，部分细菌和真菌也可用于分解木质素[5]。可以降解纤维素的真菌种类较多，分解能力较强的真菌主要分为木霉属、曲霉属、镰刀菌属。木质素可以被黄单胞菌、假单胞菌、不动杆菌等菌种分解，一般情况下真菌的分解能力比细菌强得多[6]。

本研究主要筛选高效降解秸秆纤维素的微生物菌株。通过土壤微生物的富集与分离，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)单一碳源筛选，羧甲基纤维素(简称CMC)酶活性和滤纸酶活性的测定，筛选获得高产纤维素菌株，并采用改进的Van Soest洗涤法测定供试菌株处理后水稻秸秆的失质量率与纤维素、半纤维素、木质素的含量[7]。从菌株对秸秆进行降解的培养基中提取有机物质，其中包括微生物分泌出的具有挥发性的有机化合物及其降解秸秆所产生的不同有机产物，探讨枝孢菌BD-19的秸秆生物降解能力，为秸秆高效降解提供菌种资源和技术支撑。

1 材料与方法

试验于2015年9月至2016年9月在南京晓庄学院农产品质量与安全重点实验室内进行。

1.1 材料与仪器

供试土样：试验土样取自南京市江宁区稻麦轮作农田，共50份。

主要仪器有7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometer，简称GC-MS)，由美国Agilent公司提供。

主要供试药品与试剂有：A，3，5-二硝基水杨酸(3，5-dinitrosalicylic acid，简称DNS)试剂，称量6.3 g DNS，加少量蒸馏水溶解后加入262 mL 2 mol/L NaOH溶液；B，称取 185 mg 酒石酸钾纳，加500 mL蒸馏水加热溶解。混合A、B后，加入5 g结晶苯酚和亚硫酸钠，冷却后，加入蒸馏水至 1 000 mL，用棕色磨砂广口瓶储存，保存1周后再使用。

0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH值= 4.5)：取271.2 mL溶液A，与228.8 mL溶液B混合，加入蒸馏水至 1 000 mL。

0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH值=5.0)：取205 mL溶液A、295 mL溶液B混匀后，向其中加入蒸馏水定容至 1 000 mL，即得。溶液A(0.1 mol/L柠檬酸)：21 g C6H8O7·H2O，加蒸馏水至1 000 mL。溶液B(0.1 mol/L柠檬酸钠)：称取29.4 g Na3C6H5O7·2H2O，加入蒸馏水定容至 1 000 mL。

0.51% CMC-Na溶液：称取5.1 g CMC-Na，加入少量蒸馏水后加热溶解，向其中加入5 mL pH值为5.0的柠檬酸缓冲液后混合均匀，并加蒸馏水定容至 1 000 mL。

中性洗涤剂。A：称取18.6 g乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，简称EDTA)、6.8 g 硼酸钠，加入少量蒸馏水后，适当加热溶解。B：30 g十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)、10 mL乙二醇乙醚、4.56 g无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)，加少量蒸馏水并加热溶解。将A、B混匀后加蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH值至7.0左右。

2.0 mol/L盐酸溶液：量取800 mL 蒸馏水于1 L容量瓶中，加入密度为1.19 g/mL的浓盐酸167 mL，加入蒸馏水定容至刻度。

72%硫酸溶液：取300 mL蒸馏水于1 L容量瓶中，缓慢加入密度为1.84 g/mL的浓硫酸665 mL，待冷却至室温后，加蒸馏水定容至刻度。

DNA提取液：将2.42 g Tris(三羟甲基氨基甲烷)、2.92 g NaCl、0.372 g EDTA-Na、1 g SDS溶于100 mL 去离子水中，将pH值调至8.0。

主要培养基有：(1)LB固体培养基。5 g酵母提取物、10 g 蛋白胨、5 g NaCl、15～20 g琼脂，1 000 mL超纯水，pH值为7.4。不添加琼脂的为LB液体培养基。(2)PDA培养基。称取200 g马铃薯切成小块，煮沸20～30 min，加20 g蔗糖、16 g琼脂粉，用纯水定容至1 000 mL，pH值为7.4。不添加琼脂粉的为PDA液体培养基。(3)羧甲基纤维素钠培养基。0.5 g NH4NO3、0.5 g MgSO4·7H2O、1 g酵母提取物、15 g CMC-Na，用纯水定容至1 000 mL。(4)赫奇逊氏无机盐培养基。1.0 g KH2PO4、0.1 g NaCl、0.3 g MgSO4·7H2O、2.5 g NaNO3、0.01 g FeCl3、0.1 g CaCl2，用去离子水定容至 1 000 mL，pH值为7.2 。(5)秸秆液体发酵培养基。取1.0 g经NaOH溶液浸泡并水洗至中性的秸秆于三角瓶中，再加入100 mL赫奇逊氏无机盐培养基。(6)秸秆粉末培养基。取经NaOH溶液浸泡并水洗至中性的秸秆于干燥箱，于80 ℃烘干至恒质量，粉碎过60目筛，于培养皿中加入5 g秸秆粉和 25 mL 混合溶液[0.5 g/L NaCl 、0.5 g/L MgSO4、3 g/L(NH4)2SO4、1 g/L KH2PO4、0.3 g/L CaCl2、0.01 g/L FeSO4·7H2O、0.015 g/L MnSO4·7H2O 、0.015 g/L ZnSO4·7H2O 、0.01 g/L CoCl2]，121 ℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 秸秆降解菌的初步筛选 称取5.0 g稻麦轮作农田土样，倒入含有45 mL无菌水的三角瓶中，在温度为28 ℃的条件下摇床振荡30 min后取出，为10-1浓度，用无菌水分别稀释至10-5、10-6、10-7等3个浓度梯度用于涂布，分别涂布于LB培养基、PDA无菌平板，放置于温度为28 ℃的恒温培养箱内培养2～3 d。将得到的单菌落进行分离纯化。将上述分离得到的单菌落摇瓶发酵菌液接种至CMC-Na平板培养基上，28 ℃恒温条件下培养2～3 d，观察平板上水解圈并比较其大小，选取水解圈较大、较明显的菌株。

1.2.2 纤维素酶活性测定

1.2.2.1 纤维素酶活性的测定 纤维素的酶活性主要由滤纸酶活性和内切酶活性表示。用DNS法测定还原糖含量，反应底物为非淀粉新华滤纸和羧甲基纤维素钠(CMC钠)，酶活性单位定义：1 mL酶溶液在温度为50 ℃、pH值为4.8条件下，1 min水解底物生成1.0 μmoL葡萄糖的量为1个酶单位(U)。

1.2.2.2 滤纸酶活性(FPA)的测定 在5支试管中加入 0.5 mL 酶溶液和浓度为0.05 mol/L、pH值为4.5的柠檬酸缓冲液，并向对照试管中加入1.5 mL DNS，放在50 ℃水浴锅中预热5～10 min，各加入1.0 cm×6.0 cm无淀粉新华滤纸条，在温度为50 ℃条件下保温60 min，取出后立刻向非对照试管中加入1.5 mL DNS停止反应。在540 nm处记录测定的其他各试管的D540 nm。根据葡萄糖标准曲线计算得出相应的葡萄糖含量，并计算出相应的滤纸酶活性。

1.2.2.3 内切酶活性的测定 在5支试管中加入0.5 mL粗酶液和1.0 mL 0.51% CMC-Na溶液，方法同滤纸酶活性测定。根据葡萄糖标准曲线得出相应的葡萄糖含量，并计算出其对应的内切酶活性。

1.2.3 秸秆液态发酵降解能力测定 将初步筛选出的菌株在PDA平板上培养，待其长满平板时于超净工作台中用涂布器及无菌水冲洗出菌丝及孢子，将其全部转入液体发酵培养基中，在温度为25 ℃、转速为170 r/min条件下于摇床振荡培养10 d后取出。秸秆失质量率的测定采用差质量法，通过改进的Van Soest方法测定样品中的纤维素、半纤维素、木质素的降解率。

1.2.4 高效秸秆降解菌DNA的ITS(内转录间隔区)鉴定 从筛选出的菌株中，选取酶活性及降解效果均较为突出的菌株进行鉴定。将菌株在PDA培养基上于温度为25 ℃的条件下培养5 d，转接到马铃薯液体培养基中，振荡培养7 d，收集子实体，提取DNA。以提取菌株的DNA为模板，分别以ITS1、ITS5为引物来PCR扩增ITS序列。PCR反应程序：94℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物经过纯化后送到南京钟鼎生物技术有限公司进行测序。供试菌株的ITS测序拼接序列与NCBI(美国国立生物技术信息中心)中Blast数据进行比对，并利用MEGA4.1软件构建发育进化树。

1.2.5 菌株降解秸秆产物测定 先进行菌株接种，菌株接种3 d后可进行菌丝取样，分别于接种3、5、10、20、30 d时取菌丝和培养基作为待分析样品。衍生化反应后，每个样品用于GC-MS分析后丢弃。利用AMDIS软件(NIST，v2.69，Gaithersburg，MD，USA)和MSD Chemstation软件(G1701 EAE.02.00.493，美国安捷伦科技有限公司)进行质谱峰的定性分析。将代谢物的质谱图中质量碎片峰位置和信息与标准数据库进行比对，从而对色谱图中的各个峰数据进行分析。所用谱库主要是NIST2005、Wiley。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

将来自稻麦轮作农田的土样在LB和PDA固体培养基中进行分离与纯化，共得到163株细菌，18株真菌。选用刚果红染色法和CMC-Na水解圈测定试验，根据得到的菌株菌落直径(d，cm)和水解圈直径(D，cm)，可得水解能力Dp，相关公式：Dp=(D/d)2，由此选出15株真菌。

2.2 纤维素酶活性的测定

纤维素的降解是多种酶体系共同作用的结果，本试验主要测定供试菌株的CMC酶活性以及滤纸酶活性，作为菌株复筛的依据。通过液体发酵方式，筛选得到酶活性较高的12株真菌。将试验真菌添加到PDA液体培养基中，在温度为 25 ℃、转速为150 r/min条件下摇床培养 72 h 后测定其酶活性，结果如表1所示。

2.3 秸秆液态发酵降解能力的测定

采用液态发酵的方式研究以上试验得到的12株真菌。以改进的Van Soest洗涤法测定供试菌株对水稻秸秆中半纤维素、纤维素、木质素的降解效果。

在液态培养条件下，经各菌株处理，其中BD-19菌株处理后的降解效果与其他菌株相比明显较好，其秸秆的失质量率达到44.51%，半纤维素、纤维素、木质素的降解率分别为16.64%、26.42%、11.43%(表2)。

2.4 高效秸秆降解菌的鉴定

如图1所示，将真菌BD-19的ITS测序拼接序列与NCBI中Blast数据进行比对，BD-19与枝孢属菌(Cladosporiumsp.)EU-375523的ITS序列同源性为99%[8]，结合供试菌株的菌落形态特征，可初步将其鉴定为Cladosporiumsp. BD-19。

表1 不同菌株的酶活性测定结果

注：数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著，下表同。

表2 秸秆降解后各组分含量变化

2.5 菌株降解秸秆产物的测定

将枝孢菌BD-19接种到秸秆粉末液体培养基中摇瓶培养，分别于3、5、10、20、30 d采样，进行降解秸秆所得产物的GC-MS测定，测定结果见图2至图6。

在降解过程中，检测到有机化合物如烷、醇、酚、羧酸、硅氧烷、卤代烃等。醇、酚、羧酸、硅氧烷等物质表明木质纤维素得到有效降解[9]。由表3可知，接种3 d获得6种降解物，5 d后获得13种降解物，10 d后获得17种降解物，20 d后获得5种产物，30 d后获得3种产物。可看出菌株在10 d之前降解所得有机产物逐渐增多，在10 d之后降解所得产物明显减少。其中，以接种10 d所得降解产物最多。

半纤维素是不同类型单糖构成的异质多聚体， 主要由包括木糖、阿拉伯糖、半乳糖等的五碳糖、六碳糖构成[10]。构成半纤维素的糖基主要有D-木糖基、D-甘露糖基、D-葡萄糖基、D-半乳糖基、L-阿拉伯糖基、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸基、D-半乳糖醛酸基、D-葡萄糖醛酸基等[11]。由表3可知，在接种3 d产物中有D-甘露酸；接种5 d产物中有葡萄糖醇；接种10 d产物中有D-果糖、半乳糖；接种20 d的产物中有葡萄糖酸；接种30 d产物中含有葡萄糖醇和葡萄糖酸。由此可知，本试验所用的枝孢菌BD-19菌株对秸秆中的半纤维素中所含的糖基类物质有降解作用。

表3 枝孢菌BD-19在不同时间降解秸秆的代谢产物

半纤维素主要分为3类，即聚木糖类、聚葡萄甘露糖类、聚半乳糖葡萄甘露糖类，其中聚木糖类主要是以1，4-β-D- 吡喃型木糖构成主链，以4-氧甲基-吡喃型葡萄糖醛酸为支链的多糖，其主要由β-D-吡喃型木糖基、4-氧甲基-吡喃型葡萄糖醛酸基、α-L-呋喃型阿拉伯糖构成[12]。由表3可知，在菌株降解秸秆的5 d生成了D-戊二酸呋喃糖、阿拉伯吡喃糖，由此说明，枝孢菌BD-19对半纤维素中的聚木糖有降解作用。

构成半纤维素的3种糖类中的聚葡萄甘露糖是由D-吡喃型葡萄糖基、呋喃型甘露糖基以1，4-β型连接成主链[13]。另一类聚半乳糖葡萄糖甘露糖还有D-呋喃型半乳糖基用支链形式以1，6-α型连接到此主链上的若干D-呋喃型半乳糖基、D-吡喃型葡萄糖基上[14]，由表3可知，在菌株降解秸秆的3 d，产物中有D-甘露酸出现；在5 d时，产物中有葡萄糖醇出现；30 d时，产物中有葡萄糖醇、葡萄糖酸。由此可知，枝孢菌BD-19对半纤维素中的聚葡萄甘露糖具有一定的降解作用。

分析表3中物质结构可以看出，接种3 d时碳原子数在20个以上的物质有2种，5 d时有3种，10 d时有4种，20 d时没有碳原子数在20个以上的物质，30 d时有1种。由此可见，碳链在10 d后有明显的断裂，初步推断，枝孢菌BD-19在10 d左右对秸秆的降解作用较为明显。

计算表3中物质的分子量可知，接种3 d时物质的分子量为 220～467；5 d物质的分子量为225～467；10 d时物质的分子量为153～461；20 d时物质的分子量为234～338；30 d时物质的分子量为231～338。由此可见，枝孢菌 BD-19在10 d后对秸秆的降解作用较明显。

枝孢菌BD-19接种后5～7 d菌落生长最旺盛，之后菌落直径不再扩大，在其生长期间，由于该菌细胞内纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等没有大量产生，所以在3～5 d 时枝孢菌BD-19可能对秸秆降解的速度较慢，因而所得产物较少；在5～10 d时推测，枝孢菌BD-19能产出较多的纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等，从而提高了菌株对秸秆的降解速率。

在菌株生长的后期，随着秸秆培养基中提供的糖类、碳源、氮源、无机盐等菌株生长所必需的物质逐渐减少，影响了菌株的正常生长以及现有菌株的活性，从而导致3种纤维素、木质素降解酶的产生量越来越少。与本研究所显示的结果一致，在菌株生长平稳期过后的衰亡期，有机物含量越来越少。

3 结论与讨论

本研究主要从稻麦轮作农田土样中以稀释涂平板的方法分离出各菌株，并进行纯化。选用刚果红染色法以及CMC-Na水解圈测定法，将所得菌株进行初次筛选后得到具有秸秆降解能力的15株真菌。测定这些菌株的CMC及FPA酶活性后，进一步得到酶活性较高的12株真菌。

在液态发酵条件下，将秸秆作为唯一碳源的培养基于摇床振荡培养10 d后，秸秆的形态明显发生了变化，以差质量法测定其失质量率与半纤维素、纤维素、木质素的降解率。其中，真菌BD-19降解秸秆的失质量率达到44.51%，半纤维素、纤维素、木质素的降解率分别为16.64%、26.42%、11.43%。BD-19菌株经过形态特征及ITS的系统发育分析，鉴定其属于枝孢菌属。

利用GC-MS对筛选出的高效降解秸秆菌株BD-19降解秸秆的能力进行进一步研究。通过对其降解秸秆产生有机物的分析表明，产物中除了含有少量烷烃类物质外，还含有32种有机物，从有机物的种类及含量变化上可以判断，枝孢菌BD-19对纤维素、木质素均有降解作用。