陈永亮， 高 尚， 王彦红

(1.徐州生物工程职业技术学院，江苏徐州 221006； 2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；3.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

由于耐药菌的持续出现与存在，研究者希望能获得生物的抑菌方法，近年来芽孢杆菌发展为益生菌，被广泛应用于猪饲养、禽业及水产等养殖业[1]。候选益生菌菌株主要有蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)等[2-3]。2017年6月从江苏省扬州市高邮市某养殖场饲养的散养草鸡中分离出2株芽孢杆菌，经鉴定1株为短小芽孢杆菌(B.pumilus)，另1株为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，对2株细菌的生化特点、耐药性及其对其他细菌的抑制作用等生物学特性作初步研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化，待凉至50 ℃左右时按5%的比例加入无菌绵羊血配成血琼脂培养基，倒入培养皿中，4 ℃保存备用。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、麦康凯培养基购自上海中科昆虫生物技术开发有限公司，肠杆菌科细菌生化鉴定管和药敏试纸购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 细菌分离培养

2017年6月从江苏省扬州市高邮市某养殖场饲养的600只110日龄散养草鸡中取2只消瘦的病鸡剖杀，主要病变为肝肿大且有白色斑点，脾肿大，腺胃肿大。取肝、脾、肺等组织器官，按常规无菌操作接种于血琼脂平板上，并于37 ℃条件下培养24 h，挑取单菌落分别在麦康凯培养基与血琼脂培养基上进行纯化培养，观察分离菌的生长状况和菌落形态特征。再挑选单个菌落用革兰氏染色，并于显微镜下观察细菌形态。

1.3 MALDI biotyper分析

参照MALDI biotyper分析仪的操作标准进行单个菌落点样、晾干，然后加1 μL甲酸混匀、再晾干后进机器MBT(购自德国Bruker公司，型号microflex)检测，采用flex control程序进行检测[4]。

1.4 16S rRNA基因测序

挑取单个菌落加入20 μL的16S-free H2O水中，煮沸，裂解，制备其DNA模板，按照宝生物工程(大连)有限公司的16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit方法进行PCR扩增，取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，出现大小为 500 bp 的目的片段，然后将剩余的PCR扩增产物送至金斯瑞生物科技公司进行测序。

1.5 生化试验

用接种针挑取纯化后细菌的单个菌落，按常规方法分别进行葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、木糖、棉子糖、甘露醇、鼠李糖、果糖、卫茅醇、阿拉伯糖等糖或醇类生化发酵试验，以及甲基红(MR)、二乙酰(VP)、硫化氢、淀粉水解、硝酸盐还原、明胶液化、蛋白胨水(吲哚)等试验。另外进行耐盐(7% NaCl)试验检测，置37 ℃条件下培养24 h后观察结果。

1.6 药敏试验

采用Kirby-Bauer药敏纸片法进行药敏试验，所用药敏纸片包括头孢三嗪(菌必治)、氟苯尼考、美洛西林、多粘菌素B、多西环素、新霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、庆大霉素、复方新诺明、链霉素、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、环丙沙星和妥布霉素等15种，具体操作步骤为在无菌条件下，挑取纯化后的单个菌落均匀涂布于血琼脂平板上，取6 mm药敏纸片贴于平板琼脂面上，37 ℃条件下培养24 h后观察结果，测量各抗生素纸片的抑菌圈直径。

1.7 分离菌对其他细菌的抑菌性试验

参照文献[5-6]采用琼脂扩散法进行抑菌性试验，把临床分离的鸡源大肠杆菌、鸡源金黄色葡萄球菌和鸡白痢沙门菌分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37 ℃、150 r/min 条件下培养72 h，取100 mL菌液以6 000 r/min的转速离心5 min，弃去上清液，将下部沉淀用生理盐水稀释成1×108CFU/mL的菌悬液，其中鸡源大肠杆菌和鸡源金黄色葡萄球菌悬液均匀涂布在厚度约为4 mm的营养琼脂平板上，鸡白痢沙门菌悬液均匀涂布在厚度约为4 mm的血平板上，然后在平板上打直径约为4 mm的孔，封底。用相同方法制备的芽孢杆菌菌悬液加满孔，每个菌株加样3个孔，置于适宜温度下培养24 h，测量抑菌圈直径(φ)，取平均值。判断标准[6]：φ≤5 mm，不敏感；5 mm<φ≤10 mm，低度敏感；10 mm<φ<15 mm，中度敏感；φ≥15 mm，高度敏感。

2 结果

2.1 细菌分离

将病原菌材料接种于血琼脂平板上，于37 ℃条件下培养24 h后，观察发现，在接种脾脏组织的血琼脂平板上出现完全溶血的菌落，命名为201706JS，血琼脂平板镜检结果见图1；在接种肝脏组织的血琼脂平板上出现不溶血的较大不光滑菌落，命名为201706JL，血琼脂平板镜检结果见图2，2株分离菌在麦康凯琼脂培养基上均不生长。其他组织接种后放置48 h仍无可疑菌落出现。

2.2 MALDI biotyper分析结果

MALDI biotyper分析发现，2株分离菌中的201706JS为短小芽孢杆菌(B.pumilus)，201706JL为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。

2.3 16S rRNA基因的PCR扩增及序列分析

2株分离菌的16S rRNA基因经PCR扩增后[7]，出现大小为500 bp左右的目的条带，将所测得的序列结果(图3、图4)在NCBI网站上进行BLAST搜索比对，结果表明，所获得的序列201706JS与短小芽孢杆菌(B.pumilus)(序列号：KU928365.1)的同源性为100%，201706JL与巨大芽孢杆菌(B.megaterium)(序列号：KY417160.1)的同源性为100%。

2.4 生化特性

由表1可知，2株分离菌均能发酵葡萄糖、果糖，并能够水解淀粉，但不能水解乳糖、蔗糖等糖类，耐盐试验呈阳性，MR、VP试验为阴性。

表1 2株分离菌生化试验结果

注：“-”表示阴性；“+”表示阳性。

2.5 药敏试验结果

药敏试验结果(表2)显示，2株分离菌对常用抗生素强力霉素、诺氟沙星、氟苯尼考、复方新诺明、环丙沙星、卡那霉素、 丁胺卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、链霉素、左旋氧氟沙星等均敏感。

表2 2株分离菌药敏试验结果

2.6 分离菌对其他细菌的抑菌性试验

由表3可知，鸡源大肠杆菌对分离的短小芽孢杆菌(201706JS)和巨大芽孢杆菌(201706JL)都低度敏感，鸡源金黄色葡萄球菌对短小芽孢杆菌(201706JS)低度敏感，但是鸡白痢沙门菌对2株细菌均不敏感。

表3 2株分离菌对其他细菌的抑菌结果

3 讨论

本研究从散养草鸡的脾和肝中分别分离出短小芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌各1株，通过生理生化鉴定和分子生物学鉴定，分别为短小芽孢杆菌(B.pumilus)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。这2株芽孢杆菌对强力霉素、诺氧沙星、氟苯尼考、复方新诺明、环丙沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、链霉素、左旋氧氟沙星常用抗生素均敏感，由此可知，在临床上使用抗生素不仅容易造成致病菌的耐药性，更会杀灭益生菌，引起家禽体内菌群失调，因此在家禽生产中不能一味使用抗生素，须全面考虑用药的正面和负面影响。2株芽孢杆菌对常见病原菌尤其是对鸡源大肠杆菌均有一定抑制性，初步具备了优良的益生菌株条件，加上芽孢杆菌自有的较强可逆性和益生性，适合用作生产家禽微生态制剂[8-9]。但从已知的文献可以看出，益生菌在体外试验中由于受各种因素以及细菌本身特性的影响，对致病菌的抑制性差异比较大，张红英等在抑菌试验中将芽孢杆菌菌液浓缩10倍，获得了较好的抑菌效果[10]，因此运用此类芽孢杆菌生产微生态制剂用于抗菌抑菌时应该注意加工和使用方法，这也是笔者所承担2个基金项目研究中草药配伍芽孢杆菌来替代抗生素的一个初衷。