谷 青， 赵冬梅， 张 岱， 何佳昱， 杨志辉， 朱杰华

(河北农业大学植物保护学院，河北保定 071000)

随着马铃薯成为继水稻、小麦和玉米之后的世界第四大粮食作物，中国以占全球总种植面积的26.3%和全球总产量的22.2%成为全球最大的马铃薯生产国[1]。但是，由茄链格孢(Alternariasolani)引起的马铃薯早疫病一般可对马铃薯主产区造成20%～25%的损失，严重时可达70%～80%[2]。马铃薯早疫病是一种气传多循环流行性病害，其病菌对环境的适应能力强。近年来，马铃薯早疫病在我国大多数马铃薯主产区频繁发生和流行，严重影响着马铃薯产业的健康发展[3]。病原菌的遗传变异和病菌的生存能力与对植物的致病能力有关，从而会影响病害的发生与流行，进而对病害防控产生重要影响[4]，因此，了解一个区域病原菌的群体结构对于可持续防控病害有极为重要的理论基础作用[5]。

目前，随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphic DNA，简称RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，简称AFLP)、简单序列重复区间(inter-simple sequence repeat，简称ISSR)和简单重复序列(simple sequence repeat，简称SSR)分子标记技术已被应用于茄链格孢以及其相关种类的遗传多样性研究。Sharma等利用RAPD标记分析了芸薹生链格孢(A.brassicicola)、芸薹链格孢(A.brassicae)和萝卜链格孢(A.raphani)等3种链格孢属真菌，发现其基因型分化和地理来源之间存在明显的相关性[6]。张福光利用AFLP分子标记分析河北马铃薯早疫病病菌的群体遗传结构，结果显示，供试群体的遗传多样性较高，且AFLP分支与地理来源和病原菌产孢量有一定相关性[7]。SSR是由1～6个核苷酸组成的基本单元重复多次构成的，在大多数真核生物基因组中丰富且具有高度多态性[8]。此外，SSR技术可靠，需要样品量少，且简单易操作，可产生共显性和物种特异性遗传标记，因而在群体结构研究中十分有利[9-10]。Meng等利用基因组文库开发了7对SSR分子标记，对中国的黑龙江省、河南省、云南省和福建省茄链格孢菌群体进行遗传研究，种群遗传分析表明，病菌遗传变异率很高，且菌群间无明显地理隔离，推测这可能是隐藏的有性生殖和人类介导的基因流动共同作用的结果[11]。

为明确北方一作区马铃薯早疫病病菌的遗传结构，研究其基因型与地理来源之间的关系，本研究利用笔者所在实验室基于全基因组序列开发出的5对具有多态性的茄链格孢基因组微卫星分子标记，对采自河北、黑龙江、内蒙古、辽宁和宁夏5省(自治区)的马铃薯早疫病病菌菌株进行分析，也为探讨北方一作区马铃薯早疫病病菌近年来发生流行规律的变化及防治提供参考。

1 材料与方法

本试验于2016年8—9月在河北农业大学植物保护学院马铃薯病害研究中心完成。

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株均由笔者所在实验室于田间采集典型发病叶片，取病健交界处后经组织分离所得。采集自河北、黑龙江、辽宁、内蒙古和宁夏5省(自治区)的菌种共74株，详细信息见表1。

1.1.2 供试SSR引物 本试验采用笔者所在实验室设计的5对具有多态性的SSR引物，分别是As-11933、As-36238、As-33836、As-43626、As-97240。5对引物通过超纯聚丙烯酰胺凝胶电泳(ultra polyacrylamide gel electrophoresis，简称ULTRAPAGE)纯化方法，正向引物5′端修饰Fam、Hem、Tamrad 3种荧光基团，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物详细信息见表2。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和反应体系的构建 马铃薯早疫病病菌DNA采用张福光等改良的CTAB法[12]提取。以ddH2O为阴性对照，扩增反应总体系为15 μL：7.5 μL 2×TaqPCR Master Mix，各0.15 μL 10 μmol/L引物，0.5 μL模板DNA，6.7 μL ddH2O。反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 40 s；72 ℃ 15 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后，取2 μL PCR产物经1%[1×TAE缓冲液，TAE由三羟甲基氨基甲烷(tris base)、乙酸(acetic acid)和乙二胺四乙酸(EDTA)组成]琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统上观察并拍照，将剩余PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司检测。

表1 供试菌株信息

1.2.2 SSR数据分析 根据生工生物工程(上海)股份有限公司返回的SSR标记测序峰图，记录多态性位点，有峰标记的记为“1”，无峰标记的记为“0”，在Excel中建立“0，1”矩阵。采用POPGENE Version 1.31软件[13]对5省(自治区)早疫病病菌菌株的等位基因频率、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s多样性指数(I)、群体间的遗传距离和遗传一致度进行分析。

1.2.3 马铃薯早疫病病菌聚类分析 通过MEGA 6.06软件[14]打开POPGENE Version 1.32[13]生成的dgram.plt聚类图文件，对5省(自治区)群体间亲缘关系进行编辑修饰，通过NTSYS pc 2.1[15]的SAHN邻接法进行非加权配对算术平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，简称UPGMA)聚类分析。

2 结果与分析

2.1 马铃薯早疫病病菌SSR基因座等位基因频率分析

本研究利用5对SSR引物对74株早疫病病菌株(表1)的基因组DNA对应的基因座进行PCR扩增，共检测出26个等位基因，平均每对引物检出5.2个等位基因。在供试的74个早疫病病菌菌株中，基因座As-11933被检测出的等位基因数最多，为7个，而基因座As-43626被检测出的等位基因数最少，仅有3个(表3)。

等位基因频率越高，代表该等位基因是当地的优势基因型(表3)。在26个等位基因中，有6个为单个群体所特有的，占全部等位基因的23.08%，10个为5个群体所共有的，占全部等位基因的38.46%。其中河北群体特有的等位基因有2个，分别位于As-11933、As-33836基因座中，辽宁群体特有的2个等位基因分别出现在As-33836、As-97240基因座中，内蒙古群体和宁夏群体各自特有的1个等位基因均出现在As-36238基因座中，黑龙江群体无特有等位基因(表3)。占群体全部等位基因38.46%的共有等位基因频率较高，70%在0.500 0以上，推测这是北方一作区马铃薯早疫病病菌共有的基因，而占全部等位基因23.08%的特有等位基因可能是新变异形成的基因，将来可能会对该地区马铃薯早疫病流行造成影响。

表3 5个微卫星基因座的等位基因频率及分布

注：标有“a”“b”“c”“d”的分别代表河北、辽宁、内蒙古、宁夏群体特有的等位基因。“*”代表河北、黑龙江、辽宁、内蒙古、宁夏群体共有的等位基因。等位基因对应数字表示不同片段的峰值编号。

2.2 马铃薯早疫病病菌不同区域间遗传多样性分析

由表4可知，5个早疫病病菌菌株群体的多态性基因位点数范围为14～19个，平均为17.2个；多态性基因位点比例范围为53.85%～73.08%，平均为66.16%；有效等位基因数(Ne)在1.254 8～1.400 4个之间，平均为1.319 3个；Shannon’s信息指数在0.247 4～0.368 5之间，平均为 0.306 6；Nei’s基因多样性指数在0.158 6～0.242 2之间，平均为0.197 5。河北和辽宁群体的Shannon’s信息指数和Nei’s基因多样性指数相近，黑龙江和内蒙古群体的Shannon’s信息指数和Nei’s基因多样性指数相近，而宁夏群体的这2个指数与上述4个群体相差较大。其中，尤以河北群体的Shannon’s信息指数和Nei’s基因多样性指数最高，宁夏群体的Shannon’s信息指数和Nei’s基因多样性指数最低，说明河北早疫病病菌菌株的遗传多样性最高，宁夏群体的遗传多样性最低。

表4 5省(自治区)马铃薯早疫病病菌群体的遗传多样性分析结果

2.3 马铃薯早疫病病菌不同区域间遗传分化和亲缘关系聚类分析

通过POPGENE[13]软件对5个地区群体间的遗传关系进行分析，其中遗传相似度越接近1，表明2个群体越相似。由表5可见，各群体之间相似度都很高，处于0.900 6～0.988 9之间。其中黑龙江与内蒙古马铃薯早疫病病菌群体间遗传相似度最大，遗传距离最小，分别为0.988 9、0.011 2，而宁夏与黑龙江群体间遗传相似度最小，遗传距离最大，分别为0.900 6、0.104 7。

表5 5省(自治区)马铃薯早疫病病菌的遗传相似度和遗传距离

注：对角线上方数据为遗传相似度，对角线下方数据为遗传距离。

通过MEGA软件[14]对5省(自治区)群体遗传距离进行UPGMA聚类，图1结果显示，5省(自治区)马铃薯早疫病病菌群体可以分为3类，其中黑龙江菌株和内蒙古菌株聚为1个小分支，辽宁菌株与河北菌株聚为1个小分支，宁夏菌株单独为1个分支。从地理位置上来看，黑龙江与内蒙古菌株采集地点相邻，属于东北区域，辽宁与河北菌株采集地点相邻，属于华北区域，而宁夏属于西北区域，距离东北、华北两大地域较远，这显示群体遗传距离与地理距离相符合。

2.4 马铃薯早疫病病菌微卫星聚类分析

用生物学统计软件NTSYSpc 2.1[15]进行分析，结果显示，26个等位基因组合共检测到45个基因型。其中河北检测到13个基因型，内蒙古和黑龙江分别检测到12个基因型，

辽宁检测到9个基因型，宁夏检测到11个基因型。占整个群体82.2%的37个基因型仅被检测到1次，占整个群体 17.8% 的8个基因型不止在1个区域被检测到。被测群体中最丰富的基因型①被检测到14次，占整个群体的 18.91%，分布于除宁夏外的其余4个区域，是北方一作区的优势基因型；其次，被检测到5次的基因型②是黑龙江群体的优势基因型，被检测到4次的基因型③是辽宁群体的优势基因型，分别被检测到4、3次的基因型④⑤是宁夏的优势基因型。

由树状聚类图发现，当相似系数为0.73时，可划分为2大类群，其中第2大类群菌株主要来自宁夏；当相似系数为0.76时，第1大类群可分为2个亚类群，其中第2亚群菌株主要来自黑龙江、内蒙古，第1亚群菌株遗传多样性丰富，包括河北、辽宁的绝大部分菌株，以及内蒙古、黑龙江的大部分菌株，还有2株宁夏的菌株(图2)。这些结果显示，宁夏群体与另外4省(自治区)群体的遗传距离较大，与用MEGA软件对5省(自治区)群体遗传距离进行UPGMA聚类分析的结果相符。

3 讨论与结论

在群体遗传研究中，分子标记应该集可靠性、可重复性于一体[16-17]，其中，SSR分子标记满足以上要求，且样品需要量少，简单易操作，可产生共显性和物种特异性遗传标记，因而在群体结构研究中应用广泛[9-10]。

在物种群体遗传结构研究中，物种与其地理来源之间的关系一直倍受关注。Kakvan等研究发现，链格孢属链格孢(Alternariaalternate)的基因型与其地理来源存在一定的相关性[18-19]。本研究利用SSR分子标记对中国北方马铃薯一作区马铃薯早疫病病菌群体进行了研究，发现5个群体间亲缘关系与地理来源有一定的相关性，这与张福光等利用AFLP分子标记的研究结果[12]相符。马铃薯早疫病病菌群体聚类显示，宁夏菌株和其余4个区域菌株有差别，单独成为1个分支，河北和辽宁群体、黑龙江和内蒙古群体的相似度高，这与地理分布上河北与辽宁接壤，属于华北区域，黑龙江与内蒙古菌株采集地点接壤，属于东北区域，宁夏属于西北区域，距其余4省(自治区)较远的特点相符合。东北、华北、西北三大区域的气候条件不同，易造成马铃薯早疫病病菌发生、遗传结构不同，且由于马铃薯早疫病病菌分生孢子跨区域长距离传播的能力比较低，因而易造成相邻区域间基因型更为相似的现象。而河北、辽宁、黑龙江、内蒙古群体的遗传距离小，这可能是种薯调运，随种薯材料在不同生产区域间传播，使其获得广泛的基因交流的结果。西北宁夏群体与东北、华北区域马铃薯早疫病病菌群体的遗传距离相差较大，说明宁夏马铃薯早疫病病菌与其他4省(自治区)早疫病病菌不同，今后可在防治和对药剂的敏感性方面作进一步研究。

遗传变异是种群多样性的重要因素，目前普遍认为茄链格孢菌是通过无性生殖繁殖的[20]，但是无性生殖中由基因突变、染色体变异引起的遗传变异概率是非常低的，而本研究发现，占整个群体82.2%的37个基因型仅被检测到1次，说明群体遗传多样性高，因此笔者推测，茄链格孢菌不止无性生殖。且在一些试验中，笔者发现了茄链格孢菌菌丝融合、异核体形成，以及细胞核融合的现象，这提示茄链格孢菌可能存在准性生殖现象。