余青青， 王普昶， 赵丽丽， 陈 超， 唐华江， 李继伟

(1.贵州大学动物科学学院草业科学系，贵州贵阳 550025； 2.贵州省草业研究所，贵州贵阳 550006；3.北京佰青源畜牧业科技发展有限公司，北京 100020)

燕麦(AvenasativaL.)别称玉麦，属禾本科(Gramineae)燕麦族(AveneaeDumort)燕麦属(AvenaL.)，是重要的1年生牧草、饲料和粮食作物，为自花授粉植物[1]，主要分布在北半球温带地区的北美、欧洲、东部亚洲和大洋洲，播种面积和总产量仅次于小麦、水稻、玉米、高粱和大麦[2]。燕麦主要分为2种，一种是裸燕麦，是主要的粮食作物，且具有重要的药用价值；另一种是皮(有壳)燕麦，含有丰富的营养价值，主要是饲用。燕麦的蛋白质、脂肪、矿质元素和维生素均高于小麦、水稻、玉米、高粱和大麦，钙、磷、铁、维生素E和赖氨酸的含量也都超过了其他谷类作物[3]。

饲用燕麦是高寒牧区人工草地广泛种植的1年生草料兼用作物，具有适应性强、容易种植和饲用价值高等特点，在维系高寒牧区家畜越冬和抗灾保畜中发挥着重要的作用。在贵州，饲用燕麦的生长旺季是晚秋和冬春季，具有生长快、籽实产量高等特点，是解决贵州省草地生态畜牧业冬春季节饲草料短缺的优质牧草。但长期以来，贵州省缺乏当家燕麦品种，推广的品种主要从青海、甘肃、加拿大等地购进，所购进品种在该地适应性差、生产性能不稳定。且从外地购种受影响因素较多，价格高，难以保证有长期、稳定、廉价的燕麦品种为农户所用，导致燕麦种子供不应求。因此，培育出适宜当地生长的早熟、高产、优质饲用燕麦新品种就显得尤为重要。

遗传多样性不仅仅表现在表型性状上的差异，更重要的是表现在蛋白质、染色体和DNA水平上的差异。分子标记的发展为从DNA水平检测品种及品系间的遗传多样性提供了有利的工具。ISSR技术是由Zietkiewicz等创建的一种新型的微卫星类分子标记技术，具有高多态性、可重复性、低成本、易操作以及无须知道基因组序列等优点，广泛应用于多种作物和部分牧草的品种鉴定、系统分类、遗传多样性检测、基因定位和遗传图谱构建等研究中[4-6]。因此，本试验利用ISSR分子标记的方法对7个皮燕麦品种进行遗传多样性分析，研究不同品种之间的遗传差异，为饲用燕麦在贵州引种、遗传改良、品种培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料分别为甘早、Baler、加燕2号、青海白燕麦、Hay Wire、青引2号、甜燕2号，均由北京佰青源畜牧业科技发展有限公司提供。材料原产地及编号见表1。

表1 试验材料编号及原产地

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取与检测 将材料播种于贵州大学试验场，待出苗后20 d，每个材料随机取20个单株的幼嫩叶片0.5 g均匀混合，使用植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取植物总DNA。用1.0%琼脂糖、Gold View染色凝胶电泳检测质量，保存在-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2 燕麦ISSR分析

1.2.2.1 ISSR-PCR反应体系建立及引物筛选 通过查阅相关文献资料[7-11]以及预试验，最终确定最佳反应体系为 20 μL：2×EasyTaqPCR Super Mix 10 μL、引物1 μL、DNA模板(15 ng/μL)2 μL、ddH2O 7 μL。反应程序为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，50～56 ℃(不同引物的温度不同)退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。ISSR引物是根据加拿大哥伦比亚大学公布的100个引物序列，选出50个交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，通过进一步预试验，筛选引物。引物筛选以同一燕麦的DNA为模板，设置不同的温度梯度，将所有引物在不同的温度下进行PCR扩增，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带清晰且具有多态性的引物作为此次燕麦ISSR的引物。

1.2.2.2 ISSR扩增产物的检测 PCR反应结束后，将扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳中检测。电泳条件：上样7 μL，1×TAE电泳缓冲液，120 V的电压32 min。电泳完毕后用Bio-Rad凝胶成像仪Gel Doc XR+成像，观测、保存并记录数据。

1.3 数据统计及分析

对PCR产物电泳的结果进行量化，通常认为ISSR是显性标记，同一条引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，在相同位移上有扩增带的记为1，无条带的记为0，记录清晰的电泳图谱条带，统计多态性位点，计算多态比率。所有数据统计利用NTSYS2.1、Popgene 32、Excel等软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的检测

DNA电泳检测结果见图1。电泳条带清晰且亮度高，说明所提取的DNA纯度高，没有被RNA、蛋白质污染，可以进行后续的研究工作。

2.2 ISSR引物筛选

同一燕麦的DNA在不同退火温度下进行PCR扩增，从50条ISSR引物中筛选出17条能够扩增出清晰条带且具有多态性的引物，引物的详细序列见表2。图2为退火温度 54.6 ℃ 时，24个UBC引物扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳获得的图谱。根据试验要求，从图2中选出7号引物UBC855在54.6 ℃退火温度下扩增燕麦DNA。其他引物的筛选过程与此相似。

表2 17条ISSR引物扩增结果

2.3 ISSR引物扩增产物的多态性

利用17条ISSR引物对7个燕麦品种的DNA进行PCR扩增，共获得204条清晰可辨的条带，其中多态性条带103条，平均多态性比率为50.49%，扩增的DNA片段集中在200～2 000 bp，部分扩增产物结果见图3。平均每个引物扩增出12条带，6.06条具有多态性(表2)，其中多态性最高的为 63.64%(引物UBC844和UBC840)，低的只有15.38%(引物UBC888)。

本试验通过3次重复可以看出，扩增出的DNA片段长度基本相同，重复性较高，只有较弱的条带重复性差。说明引物的重复性好，可以继续后续的燕麦间遗传多样性研究，以及品种间遗传距离的分析，为燕麦引种及杂交育种奠定基础。

2.4 ISSR标记的遗传相似性分析

采用Popgene 32软件计算燕麦品种间的遗传相似系数(GS值)，得到供试品种的相似性矩阵(表3)。遗传相似系数越大，表明亲缘关系越近；遗传相似系数越小，表明亲缘关系越远。7个燕麦品种的GS值为0.855～0.945，变幅为0.09。其中，加燕2号和Hay Wire二者之间的遗传相似系数最大(0.945)，表明加燕2号和Hay Wire的亲缘关系较近，遗传差异最小；早甘和青海白燕麦遗传相似系数最小(0.855)，表明早甘和青海白燕麦的亲缘关系较远，遗传差异最大，存在较高的遗传多样性。遗传相似性分析可知，供试品种之间有一定的遗传差异性。

表3 基于ISSR标记的7种燕麦的遗传相似系数矩阵

2.5 ISSR标记聚类分析

根据遗传相似系数矩阵，利用NTSYS 2.1软件进行聚类分析。在遗传相似系数为0.914时，7种燕麦分为4类(图4)，第1类为甘早，其产地为我国甘肃山丹；第2类包括加燕2号、Hay Wire、青引2号和甜燕2号，其中加燕2号、Hay Wire、甜燕2号原产地为加拿大；第3类为Baler，其产地为加拿大；第4类为青海白燕麦，其产地为我国青海。聚类结果初步证实了ISSR分子标记对7种燕麦进行亲缘关系分析的可行性。

3 结论与讨论

燕麦表型性状的数量是有限的，容易受到外界环境的影响，从传统的形态学分类方法来区分较难。分子标记能从DNA水平上检测遗传变异，被认为是物种亲缘关系研究的有力工具。刘欢等利用8个ISSR引物在48份燕麦材料中共获得144条扩增带，其中多态性条带126条，平均多态率为 86.1%[7]；王茅雁等利用RAPD标记对我国21份燕麦材料的遗传差异及类群划分的研究中，22个多态性引物共扩增出114条条带，其中85.1%具有多态性[12]。Pal等用RFLP分析燕麦属13个种间存在41%的多态性[13]。本研究从50个ISSR引物中筛选出17个多态性明显、条带清晰、反应稳定的引物，共扩增了204条谱带，多态性条带有103条，平均每个引物能扩增出12个条带，多态性比率为50.49%。与以上研究结果相比，在检测技术上，本研究使用的技术是相对成熟的琼脂糖凝胶电泳检测，其检测结果比较可靠。另外，燕麦是自花授粉植物，利用ISSR标记分析的准确性也相对较高。在检测结果方面，各研究中相关的分子标记都能产生各自有效的多态性条带，但本研究揭示的燕麦品种间遗传差异相对较小，这可能是供试品种数量少和所选品种种性差异所致。

本研究利用ISSR技术所统计的遗传相似系数，能反映不同材料间的遗传距离及关系。供试的7个燕麦品种的遗传相似系数(GS)0.855～0.945，表明供试燕麦品种间遗传相似系数和遗传距离的变化范围相对较小。其中，加燕2号和Hay Wire二者之间的遗传相似系数最大(0.945)，表明加燕2号和Hay Wire的亲缘关系较近，遗传差异最小，因为两者都来自同一原产地，育种时是否拥有共同祖先还须进一步查证；甘早和青海白燕麦遗传相似系数最小(0.855)，表明甘早和青海白燕麦的亲缘关系较远，遗传差异最大，可能是因为2个品种来自不同的地方，由于地域、环境等差异造成品种间存在较大的遗传差异，又或者因其父母本之间具有相对较远的遗传距离。在植物杂交育种中，具有较大遗传距离的2个种或品种之间更容易获得遗传性状较多的杂交种。因此，在得知各品种间遗传距离的情况下，能够科学地指导杂交育种和品种改良的进行。总之，本研究主要针对贵州省目前引进的品种开展遗传差异鉴定，所得结果能较好地为贵州省燕麦育种提供理论依据。