郭文婷， 张鹏飞， 李潇玲， 张 析， 张 薇

(石河子大学农学院/新疆绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子 832000)

枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.)是一种真菌性土传病害，由尖孢镰刀菌引起。枯萎病对棉花的生产发展造成了严重的损失。由于枯萎病病菌自身的一些传播特点，传统的防护措施及一些治病方法效果不是很理想，因此培育和种植抗枯萎病品种是一种有效的办法。陆地棉种抗病基因资源较丰富，因此从陆地棉中分离抗枯萎病相关的基因，通过转基因技术可为海岛棉抗枯萎病育种奠定基础。

当植物被病原菌侵染时会发生一系列的应激防卫反应，其中一些植物的内源性激素发挥重要作用。另外，一些转录因子在植物抗病中扮演着重要角色，它们通过结合下游基因启动子中顺式元件，调节下游防卫基因。AP2/ERFBP转录因子中的ERF亚家族主要参与了植物体的生物和非生物胁迫下的应答反应。ERF亚家族转录因子只含有1个保守的AP2/ERF结构域，一般由58～59个氨基酸残基组成[1-2]。很多信号分子可以诱导ERF转录因子，当病原菌侵染棉花时，棉花自身会发生应激反应而产生许多小分子物质，如乙烯(ethyl ene，简称ET)、水杨酸(salicylicacid，简称SA)、茉莉酸(jasmonicacid，简称JA)等激素，这些激素发挥信号分子的作用[3]，此外大多数ERF转录因子在植物抗病过程中处于信号交叉途径，发挥着连接因子的作用[4]。莫纪波等研究发现转录因子在不同的激素互作中发挥重要作用，进而激活了植物抗病信号途径中的一些信号通路[4]。金莉研究发现，GbERF1转录因子基因通过增强抗病相关基因的表达，从而提高棉花的抗病能力[5]。刘坤等克隆了GbEREB5和GbEREB6这2个属B3亚组的转录因子基因，研究发现可以提高NtCHI-B、NtPR2等PR蛋白基因的表达量[6]。在作物中过量表达ERF类转录因子基因，可以使下游的一些抗病基因和一些与抗病相关的基因呈上调表达，不仅提高了作物对某种单一病害的抗性，而且增加了作物对多种病害的抗病力[7]。转录因子在植物抗病中具有更高的应用价值。与转入单一的抗病基因的转基因方式相比，其能够激活或抑制多个下游基因的表达，进而获得抗病力更强的转基因植株[8]。目前，虽然棉花中ERF转录因子数目较多，但是对它们功能的研究还不是很深入。在海岛棉中，对抗枯萎病相关的ERF转录因子基因的研究有限，ERF转录因子与植物内源性激素之间的互作尚不明确。本研究用对枯萎病病菌有差异表达的ERF为探针，克隆了ERF-B3亚组的转录因子基因GhERF5-1，利用生物信息学分析GhERF5-1基因的结构、qRT-PCR技术分析GhERF5-1基因在枯萎病病菌处理下的表达模式，希望能够为海岛棉抗病提供新的基因资源和为作物抗病分子育种提供有用的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为陆地棉品种中棉所12，由石河子大学农学院育种教研室保存；枯萎病病菌菌株为F430，由石河子大学农学院植物保护系张莉老师惠赠。将籽粒饱满的种子用10%的过氧化氢溶液浸泡2～3 h后，用ddH2O冲洗6遍后种植于蛭石中。当棉苗长出第1张真叶时，转移到霍格兰培养液中于(24±3) ℃、光照16 h、黑暗8 h在培养箱中培养。待棉苗长至2叶1心时，选取生长一致的棉苗，分别浸于浓度为1×107个/mL的枯萎病病菌孢子悬浮液、1 mmol/L乙烯、50 μmol/L 水杨酸和 1 mmol/L 茉莉酸甲酯的霍格兰营养液中40 min，然后转入霍格兰营养液中。以相同生长条件下用水处理的棉苗作为平行对照Mock，分别在0、1、2、3、6、12、24、48 h时间点取处理棉苗和对照的根部组织，液氮冷激后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 基因全长cDNA的克隆 利用笔者所在实验室得到的棉花抗枯萎病表达谱中的ERF序列为探针，在NCBI网站用tBlastn方式比对搜索，下载同源性高的ESTs序列；利用CAP3拼接软件进行ESTs的拼接，将拼接完整的序列进行分析，找到其ORF后利用NCBI寻找其保守域；利用MEGA 5.0构建系统发育树分析所得电子序列与已知ERFB3亚组基因的亲缘关系。使用Oligo 7设计全长引物(上游引物F1：GGGGTACCATGGAAAGTAGCAGTGAAGTGTC；下游引物R1：CGGGATCCGATGACCGTAACTTGTTGAAAGC)。棉花总RNA的提取采用CTAB法，通过反转录得到cDNA后进行PCR扩增，得到预期大小的基因片段，连接pMD19-T载体后，利用热激法将质粒转入大肠杆菌，筛选阳性克隆进行测序。

1.2.2 生物信息学分析 在NCBI数据库和Cottongen数据库的基础上，利用生物信息学软件分析GhERF5-1基因的开放读码框、编码蛋白的理化性质、蛋白亲疏水性、蛋白高级结构等，多序列比对用DNAMAN软件，用MEGA 5.0软件做进化树分析。表1为所用的生物信息学分析软件。

1.2.3 实时荧光定量PCR分析 根据目的基因的cDNA序列设计qRT-PCR上游引物Fq：CCTAAGCCCTTTGAATTTAC-ACCT和下游引物Rq：CCACTCTACTTTATGCGGTAACGA；以棉花的持家基因GhUBQ7作为内参基因，上游引物Fu：GAAGACCTACACCAAGCCCAAG；下游引物Ru：CGGACTCTA-CTCAATCCCCACC。试验共设3个重复，最后采用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。

表1 生物信息学分析软件及在线分析工具

2 结果与分析

2.1 基因全长cDNA的克隆

以笔者所在实验室前期获得的枯萎病病菌诱导棉花根部基因表达谱中有明显差异表达的ERF数据为基础，利用电子拼接方法得到1条长度为990 bp的序列。用ORF Finder在线软件分析得出，该基因开放阅读框(ORF)为990 bp，根据该ORF序列设计全长引物，以前期获得的中棉所12的棉花根部cDNA为模板，扩增出1条长度约1 000 bp的片段(图1)，筛选阳性克隆进行测序，结果表明，该基因全长为990 bp，与电子克隆序列一致，通过和拟南芥ERFB3亚组基因进行系统进化树分析，结果发现，该基因在进化上与拟南芥B3亚组的AtERF5亲缘关系最近，所以将该基因命名为GhERF5-1(GenBank登录号：MF145657)。

2.2 生物信息学分析

2.2.1 多序列比对及同源进化分析 从NCBI下载10个已知拟南芥ERF-B3亚组的基因进行多序列比对分析，结果发现，GhERF5-1基因编码氨基酸序列在180～244之间，含有构成了ERF亚族转录因子典型的AP2结构域(图2)。为了进一步分析GhERF5-1基因与ERF亚族其他转录因子之间的进化关系，利用MEGA 5.0软件，将该基因编码的氨基酸与拟南芥的ERF-B3亚组氨基酸序列作同源进化树分析，结果(图3)表明，GhERF5-1基因编码的蛋白与拟南芥AtERF5同处于1个分支，说明该基因在进化上与拟南芥ERF-B3亚组的基因AtERF5亲缘关系最近，进一步说明GhERF5-1基因属于ERF-B3亚组。

2.2.2 基因编码蛋白的一级结构分析 对该基因编码蛋白的理化性质进行分析可知，该基因编码329个氨基酸，蛋白分子量为36.52 ku，分子式为C1 614H2 488N450O510S5，理论等电点为6.15。在组成这个蛋白的所有氨基酸中，所占比例最高的为丝氨酸(Ser)，达到12.5%。甲硫氨酸(Met)含量最低，为0.6%。蛋白的不稳定指数为47.36，脂肪指数为61.12，总平均亲水性为-0.701，预测该蛋白为1个亲水的不稳定蛋白。

2.2.3 基因编码蛋白磷酸化分析和亲疏水性分析 磷酸化和去磷酸化是蛋白质翻译后修饰中的重要形式之一[9]。基因的结构决定其功能，蛋白质磷酸化在蛋白结构功能的研究中具有重要的意义。利用NetPhos 3.1 serve(http：//www.cbs.dtu.dk/services/DetPhos/)预测该基因编码蛋白的磷酸化位点(图4)，结果显示，该蛋白总共含有29个丝氨酸、11个苏氨酸和1个酪氨酸磷酸化位点。因此推测在棉花上，GhERF5-1基因有可能被酪氨酸激酶、丝氨酸激酶、苏氨酸激酶磷酸化修饰后激活调控基因的表达，进而调控蛋白的活性。对GhERF5-1基因编码的蛋白进行亲/疏水性分析，结果见图5。在多肽链中，第258位的氨基酸亲水性最强，分值为 -3.3；第310位的氨基酸疏水性分值最高，为1.2。说明该蛋白是1个亲水蛋白，进一步说明该蛋白是1个不稳定蛋白。

2.2.4 蛋白高级结构预测 对该基因编码的蛋白进行二级结构分析，结果见图6。分析表明，该蛋白二级结构的主要组成元件是α螺旋与无规则卷曲，β折叠只占15.81%。由图6可知，GhERF5-1基因编码的蛋白质二级结构中最主要的结构原件是以无规则卷曲的形式存在，α螺旋分散在整个蛋白中。蛋白的结构功能域分析结果(图7)显示，该蛋白在 180～244之间是个高度保守的AP2结构功能域，该结构域是ERF亚家族共有的典型结构域。AP2结构保守域的C端序列是由18个氨基酸残基组成的核心序列，形成双亲性的α螺旋参与了同DNA元件或其他转录因子间的相互作用，N端的碱性亲水区是由3个反向平行的β-折叠构成[10]。三级结构的同源建模分析，预测GhERF5-1转录因子基因的立体结构，结果(图8)表明，GhERF5-1转录因子的ERF结构域与拟南芥的AtERF5的非常相似，由此推测GhERF5-1所编码的蛋白可能有与AtERF5有相同的特性，可以与下游基因启动子中GCC-box结合，从而实现对下游抗病基因的激活。

2.3 实时荧光定量PCR分析

利用qRT-PCR分析枯萎病病菌处理后GhERF5-1基因的表达。结果(图9)发现，枯萎病病菌处理抗病品种中棉所12号后，该基因的相对表达量均高于平行对照Mock，为上调表达。枯萎病病菌侵染后，随着侵染时间的延长，GhERF5-1基因的表达趋势是先增加后降低，在处理后2 h，该基因的相对表达量迅速增加，达到最大，是Mock的3倍，随后表达量逐渐降低，48 h时，其相对表达量与对照Mock基本相同。由此可知，GhERF5-1基因对枯萎病有明显的响应，推测该基因在棉花抗病中可能发挥一定的作用。

3 讨论

ERF亚族作为植物特有的一类转录因子，在植物应激反应中发挥着很大作用。ERF-B3亚组转录因子通过与其下游PRs基因启动子中的GCC-box顺式作用元件结合，进一步调控PRs基因的表达，如AtERF1通过结合PR基因PDF1.2启动子中的GCC-box， 从而激活其表达[11]。郭伟峰等从海岛棉品种海7124中克隆了乙烯信号路径的1个ERFs类转录因子基因GbERF1-like，研究发现其参与棉花的抗病反应，在棉花抗黄萎病中有重要的调节作用[12]。何兰兰等利用电子克隆技术克隆了ERF-B3亚组转录因子基因GhB301，发现其对枯萎病有一定的响应[13]。本试验利用电子克隆及RT-PCR技术，从棉花抗枯萎病品种中棉所12的根部cDNA克隆得到1个ERF转录因子GhERF5-1，序列分析表明，该基因cDNA全长990 bp，编码329个氨基酸，无内含子。系统进化树分析表明，GhERF5-1属于ERF-B3亚组的转录因子。对该基因编码的蛋白序列进行同源比较及结构域分析，发现该基因在180～244之间有1个高度保守的AP2结构功能域。进一步对该基因进行表达分析，结果发现，枯萎病病菌诱导后，该基因对枯萎病有明显的响应，本试验结果与孟宪鹏对EREB1基因和EREB2在受到黄萎病菌的诱导后基因的表达分析结果[14]一致。

蛋白质翻译后的修饰最常见的是糖基化、磷酸化、甲基化和ADP核糖基化，其中蛋白磷酸化是十分重要的蛋白翻译后修饰[9]。它是通过蛋白质激酶的作用把磷酸基团转移到丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上的一系列反应[15]。植物通常通过蛋白之间的相互磷酸化或者自磷酸化来调整蛋白在体内的活性[16]。研究发现，ERF转录因子基因含相对保守的一些磷酸化位点[17]，进一步研究认为，ERF转录因子基因的磷酸化修饰可能与转录活性的调控或蛋白稳定性有关[4]。本研究发现，GhERF5-1基因编码蛋白含有29个丝氨酸、11个苏氨酸和1个酪氨酸磷酸化位点，推测该基因可能通过磷酸化反应参与一些激素的信号通路，进而响应胁迫。

目前在棉花中对抗病相关的ERF-B3亚组基因研究不是很多，本试验克隆得到的基因初步分析对棉花枯萎病有一定的响应，但是该基因在抗病调控途径中具体的调控机制还不是很清楚，有待进一步研究。

4 结论

生物信息学分析表明，该基因的cDNA全长为990 bp，总共编码329个氨基酸，分子量36.52 ku，等电点为6.15，编码的蛋白是1个亲水的不稳定蛋白。qRT-PCR分析结果表明，枯萎病病菌侵染后，随着侵染时间的延长，GhERF5-1基因的表达趋势是先增加后降低，在处理后的2 h基因的相对表达量是5.91，达到最大，是Mock的3倍。从3 h起，相对表达量逐渐降低，12 h的相对表达量最低，为0.19。