张 林， 叶红玲*， 姚 军， 徐基艳

(1. 安庆职业技术学院 园林园艺系，安徽 安庆 246003；2. 安庆市食品药品检验中心，安徽 安庆 246000)

蓝莓是天然花青素的优质来源，蓝莓鲜果中花青素含量高于其它果蔬[1]。大量研究表明，蓝莓花青素具有抗氧化、抗心血管疾病、预防眼疾等多种功效[2-4]，在食品药品和化妆品领域具有广阔的发展前景。自2008年以来，我国蓝莓种植业迅速发展，北起黑龙江，南至海南，东起渤海之滨，西至西藏高原，全国规模化种植的省、直辖市达到27个。2004年以来，安徽怀宁在安徽省农业科学院的帮助下开启了蓝莓产业化种植之旅，截至2018年4月，全县累计种植面积超过2.3万亩。怀宁县人民政府印发了《安徽省怀宁县蓝莓产业发展规划(2016～2025)》，规划至2020年，全县蓝莓种植面积不少于5万亩，并形成年消纳蓝莓鲜果7.5万吨及加工15万亩蓝莓鲜果的深加工能力。

蓝莓鲜果50%以上用于深加工[5-6]，产品包括蓝莓果汁、果酒、果醋、果酱、酵素等，蓝莓深加工成液体产品产生大量废弃物(果渣)，而果渣中花青素含量较丰富[7-9]，但其综合利用程度却很低，导致了资源浪费[10]。本文以蓝莓果渣为原料，通过纤维素酶水解法提取果渣中花青素[11]，操作简单易行、生产工艺参数易控制，相对于超声波和微波法等方法提取果渣花青素[12-13]，生产成本明显降低，且提取花青素后的酶解液仍可用于其它蓝莓副产品的加工，充分提高了果渣的利用率。研究成果旨在为当地及其它地区蓝莓种植、加工企业提高蓝莓加工废弃物的综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

蓝莓果渣由安庆市锦华蓝莓有限公司提供(2017年7月采集的兔眼蓝莓和南方高丛蓝莓的成熟果实，1∶1混合后榨汁剩余果渣)；纤维素酶(食品级,南宁庞博生物工程有限公司出品)；矢车菊3-O-葡萄糖苷标准品(美国Sigma公司出品，批号：20170217)；其它试剂均为分析纯，购于国药试剂公司。

AUY120型电子精密天平(日本岛津公司)；SP-723可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；HWS-24数显恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 样品预处理方法

果渣经恒温干燥至恒重、粉碎后过80目筛，筛下果渣粉用于花青素提取试验[14-15]。

1.3 单因素试验

称取1 g蓝莓果渣粉，移入pH 4.8的水溶液浸提，设定料液比1∶15 (g/mL)、浸提温度为50 ℃，纤维素酶的添加量为10 FPU/g果渣，提取时间为24 h，固定其它条件，以提取液中花青素含量为指标，依次进行下列单因素条件筛选：提取液中酸的种类(苹果酸、柠檬酸、甲酸、盐酸)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50)、提取时间(6、12、18、24、30、36、42、48 h)、纤维素酶的添加量(20、30、40、50、60、70、80 FPU/g果渣)。

1.4 正交试验

在单因素试验的基础上，选择提取液中酸化剂的种类、料液比、纤维素酶的添加量、提取时间为影响因素，每个因素分别选取3个水平，设计L9(34)正交试验(表1)。

1.5 花青素提取量测定

酶解结束后，过滤收集酶解液即为花青素粗提液。采用双波长pH示差法，以矢车菊3-O-葡萄糖苷为参照。各吸取1 mL花青素粗提液于2支10 mL比色管中，分别加入9 mL pH=4.5 NaAc-HAc缓冲溶液(0.4 mol/L)和9 mL pH=1.0的KCl-HCl溶液(0.25 mol/L)，涡旋混合后，倒入1 cm比色皿，分别在510 nm和700 nm处测定吸光值，蒸馏水代替样品做空白对照，花青素的提取量按公式(1)计算[16]。

(1)

式中：A=(A510 nm, pH=1.0-A700 nm, pH=1.0)-(A510 nm, pH=4.5-A700 nm, pH=4.5)；M为矢车菊3-O-葡萄糖苷摩尔质量，449.21 g/mol；K为溶液稀释倍数；ε为矢车菊3-O-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26 900 L/(mol·cm)；L为比色皿光程，1 cm。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酸化剂种类对花青素提取量的影响 固定单因素试验中其它条件，分别以柠檬酸、苹果酸、甲酸和盐酸为酸化剂，将浸提水溶液的pH值调节至4.8，果渣经酶解后测定花青素提取量。从图1中可以看出，不同酸化剂对花青素提取量的大小顺序为：甲酸>盐酸>柠檬酸>苹果酸，且甲酸和盐酸对花青素的提取效果优于柠檬酸和苹果酸。其中以甲酸和盐酸为酸化剂时，果渣中花青素的提取量分别为1.70 mg/g和1.68 mg/g。故选择柠檬酸、甲酸、盐酸进行正交试验。

图1 酸化剂对花青素提取效果的影响Fig.1 Effects of acidulants on the extraction of anthocyanin

2.1.2 料液比对花青素提取量的影响 从图2可看出，盐酸酸化后的提取剂，其料液比由1∶10增至1∶35时，花青素提取量与料液比呈正相关。料液比在1∶35～1∶45时，花青素的提取量增加不明显，当料液比扩大到1∶50时，花青素提取量反而下降，可能是料液比过度增大，稀释了酶浓度，减少了酶和底物接触的机会。从生产的角度出发，选择料液比1∶35的花青素提取量最大，此时花青素提取量为2.09 mg/g。

图2 料液比对花青素提取效果的影响Fig.2 Effects of solid to liquid ratio on the extraction of anthocyanin

2.1.3 提取时间对花青素提取量的影响 以盐酸为酸化剂，料液比选择1∶35，考查不同提取时间对花青素提取量的影响(图3)。提取时间由6 h延长至24 h，花青素提取量随提取时间的延长而增加，提取时间为24 h时，提取效果最佳，每克果渣可提取花青素2.66 mg。当提取时间超过24 h直至48 h时，花青素提取量不再显著增加，这可能是酶的效率已经充分利用或果渣中花青素提取已经较完全。因此选择提取时间为24 h。

图3 提取时间对花青素提取效果的影响Fig.3 Effects of extraction time on the extraction of anthocyanin

2.1.4 酶添加量对花青素提取量的影响 以盐酸为酸化剂，料液比选择1∶35(g/mL)，提取时间定为24 h，考查纤维素酶不同添加量对花青素提取量的影响。如图4所示，当纤维素酶的添加量达到50 FPU/g果渣后，持续增加纤维素酶的用量，花青素的提取量不再增加，这可能是因为底物已被酶充分分解，花青素已经完全释放。为了节约成本，避免造成酶制剂的浪费，选择酶的添加量为50 FPU/g果渣。

图4 酶添加量对花青素提取效果的影响Fig.4 Effects of enzyme dosage on the extraction of anthocyanin

2.2 正交试验结果

由表2可知，4个因素中极差最大的是A因素(酸化剂种类)，极差最小的是D因素(提取时间)。4个因素对花青素提取量影响由大到小顺序为：酸化剂种类>料液比>酶的添加量>提取时间，最优组合为A3B3C1D2，按此方案进行验证试验，花青素提取量为2.84 mg/g果渣。在正交试验9组组合中，第8组试验方案最优，花青素提取量为2.82 mg/g。比较这两组试验组合，花青素提取量较为接近，但第一种方案料液比较大，增加了后期浓缩成本，从生产角度考虑，推荐酶解法提取花青素最佳条件为：调节提取水溶液pH 4.8、料液比1∶35(g/mL)、每克果渣添加40 FPU纤维素酶、保温酶解36 h。

表2 正交试验结果Table 2 The result of orthogonal experiment

续表2Table 2 Continued

3 结论与讨论

田密霞等曾对60种蓝莓鲜果中花青素含量进行检测[17]，发现不同品种蓝莓鲜果中花青素含量差异明显，最高含量可达8.69 mg/g鲜果，最低则为1.25 mg/g鲜果。而蓝莓果渣中花青素含量的高低与原果品种、加工工艺有密切关系。本文通过单因素试验，比较了不同酸化剂、提取时间、纤维素酶的添加量和料液比对蓝莓果渣中花青素提取效果的影响。在此基础上，通过正交试验和验证试验，确定纤维素酶水解蓝莓果渣提取花青素的最佳提取工艺为：用盐酸调节浸提水溶液pH至4.8，料液比1∶35(g/mL)，酶添加量为40 FPU/g果渣，50 ℃ 酶解36 h，此条件下花青素的提取量为2.82 mg/g果渣。酶法提取蓝莓果渣花青素操作工艺简便合理,较大程度地提高了蓝莓资源的综合利用率。