韦云路，李 璐，李全宏*

（中国农业大学 食品科学与营养工程学院 国家果蔬加工工程技术研究中心 农业部果蔬加工重点开放实验室，北京 100083）

南瓜（Cucurbita spp.）属葫芦科南瓜属，一年生草本植物[1]，其营养价值丰富，具有多种保健和药用功效。南瓜果实中不仅含有多糖、果胶、纤维素等碳水化合物类，还含有蛋白质、脂肪、维生素及矿物质等多种营养物质，同时南瓜提取物还可作为药材[2]。研究表明，南瓜具有抗氧化、抗肿瘤[3]、保肝护肝[4]、降血脂[5]、调节免疫[6]和改善Ⅱ型糖尿病[7]等益生作用。在我国广泛种植栽培南瓜的大背景下，南瓜的综合利用尚不完善，主要作为蔬菜以鲜食为主，通过深加工技术开发多种南瓜产品以提高南瓜的附加值，其市场及产业化前景更加广阔[8-9]，因此，研究开发新型的南瓜功能性食品有利于南瓜资源的开发利用。随着生活水平的提高，人们对食品的要求也不仅只停留在解决温饱，而是更加注重其营养和保健功效。以果蔬为原料开发的果蔬醋大多数都果香、醋香浓郁，营养丰富、酸甜可口[10]，加以利用复合菌株在发酵过程中的相互协作，通过微生物代谢途径产生丰富的代谢产物，产生既能够保留原料的营养成分和香气成分，又兼具有保健功能的果醋产品，具有广阔的消费市场和开发前景[11]。VIANA RO等[12]研究以开菲尔菌种酿造苹果醋，发现开菲尔苹果醋中有机酸种类和含量丰富，且含有多种微生物，经鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）、巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus）和Acetobacter syzygii。李迎楠[13]采用复合菌株发酵酸浆果醋并研究其活性成分，发现得到的酸浆果醋口感柔和，营养成分丰富，总酸含量可达51 g/L，含有多种氨基酸和有机酸，同时含有1.31 mg/mL胡萝卜素。吴茂玉等[14]在苹果醋酿造过程中采用增香酵母和乳酸菌进行发酵，制得的果醋饮料澄清透明，光泽度好，且具有苹果特有的果香。

本研究开发了一种新型的复合菌株发酵南瓜醋饮料，以南瓜为原料，将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）沪酿1.01与嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）复合菌株以一定的比例接种于经过复合酶处理的南瓜浆中进行发酵，酵母菌可以首先分解利用果蔬原料中的大分子营养物质，通过代谢碳水化合物产生乙醇；而通过醋酸菌的作用，可进一步将乙醇转化为乙酸；加上嗜酸乳杆菌可以代谢乙酸和部分有机酸生成风味较为柔和的乳酸，积累丰富的有机酸等代谢产物[13]，从而制得既具有南瓜保健成分，又香气浓郁、口感醇厚的南瓜醋产品[15]。果醋类产品对澄清度要求较高，因此本研究考察澄清剂种类、澄清剂复配比例以及澄清温度和时间对南瓜醋的澄清效果的影响，并通过单因素和正交设计优化南瓜醋的澄清工艺条件，并考察南瓜醋的抗氧化能力，以期为新型发酵南瓜醋的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料及菌株

新鲜南瓜：市售；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）沪酿1.01、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）：中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。

1.1.2 化学试剂

β-葡聚糖酶（10万U/g）：山东欣鼎生物科技有限公司；糖化酶（5万U/g）：多味化工食品有限公司；纤维素酶（2万U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；果胶酶（5万U/g）：和氏璧生物科技有限公司；明胶、壳聚糖、硅藻土和羧甲基纤维素钠（均为食品级）：郑州安安康食品原料有限公司；皂土（食品级）：烟台帝伯仕自酿机有限公司；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：北京化工厂；总抗氧化能力测试盒、抑制羟自由基试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.3 培养基

麦芽浸粉肉汤（malt extract broth，MEB）培养基：麦芽浸粉 20 g/L，pH调至6.9±0.2，121℃灭菌15 min。用于酵母菌的培养。

MRS肉汤培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母粉5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，硫酸镁0.1 g/L，醋酸钠5.0g/L，柠檬酸铵2.0 g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，吐温80 1.0 mL/L，硫酸锰0.05 g/L，pH调至6.9±0.2，121℃灭菌15 min。用于乳酸菌的培养。

醋杆菌培养基：葡萄糖30 g/L，酵母提取物10 g/L，121℃高压灭菌15min，临用前加4%过滤除菌的无水乙醇。

1.2 设备与仪器

JYZ-E91九阳料理机：九阳股份有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：天津科诺仪器设备有限公司；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱、DHP-9082型电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；TGL-16A台式高速冷冻离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司：UV-2802紫外可见光分光光度计：尤尼科（上海）仪器有限公司；imark酶标仪：美国Bio Rad公司；HZQ-F160全温度振荡培养箱：太仓市豪诚实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 复合菌株发酵南瓜醋的加工工艺流程及操作要点

南瓜浆的制备：新鲜南瓜洗净、去皮、切块，将南瓜块与蒸馏水按照1∶3（g∶mL）置于料理机中打浆，得到新鲜的南瓜浆。

酶解：采用由糖化酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和果胶酶（1∶1∶1∶1）组成的复合酶进行酶解，总酶添加量为0.4 g/L，酶解温度50℃，酶解时间50 min，沸水浴10 min灭酶。

杀菌、冷却：酶解南瓜浆121℃高压蒸汽灭菌15 min，冷却至室温后备用。

接种发酵：按总接种量10%，复合菌种接种比例（酿酒酵母/巴氏醋杆菌沪酿1.01/嗜酸乳杆菌1∶2∶2），先向南瓜浆中接种2%酿酒酵母菌，30℃培养2 d，再向其中接种4%巴氏醋杆菌沪酿1.01，30℃培养3 d，最后接种4%嗜酸乳杆菌，30℃培养2 d，结束发酵。

澄清：考察澄清剂种类、复配比例、静置温度和静置时间对南瓜醋的影响，优化澄清工艺，得到南瓜醋成品。

1.3.2 单一澄清剂的筛选

将配制的1%明胶溶液、硅藻土悬浮液、壳聚糖溶液、羧甲基纤维素钠溶液及皂土悬浮液分别以1%、2%、3%、4%、5%加入等量的复合菌株在最佳工艺条件下发酵的南瓜醋中，25℃静置12 h，离心（8 000 r/min、10 min）、过滤，取上清液测定透光率，每组做3次平行试验，选取效果最佳的澄清剂及其最适的添加比例。

1.3.3 南瓜醋澄清工艺优化单因素试验

根据单一澄清剂的筛选试验结果，选取两种效果较好的澄清剂进行复配，复合澄清剂添加量4%，并探究壳聚糖和明胶体积比（1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、1∶1）、静置温度（5 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃、45℃）和静置时间（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）对澄清效果的影响。

1.3.4 南瓜醋澄清工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，复合澄清剂添加量4%，以复配比例（A）、静置温度（B）和静置时间（C）3个因素进行正交试验。使用Minitab 16软件，以透光率为评价指标，采用L9（34）正交试验，确定复配澄清剂澄清南瓜醋的最佳澄清工艺条件。

1.3.5 分析检测

澄清度的测定：取澄清后的南瓜醋，经离心和过滤后，取清液，在波长650 nm条件下，以蒸馏水为参比，测定清液的吸光度值A，计算溶液的透光率T，计算公式为T＝10-A。总酸含量的测定：采用酸碱滴定法；有机酸测定：乳酸、丁二酸（琥珀酸）、柠檬酸、酒石酸和富马酸含量的测定参考国标GB 5009.157—2016《食品安全国家标准食品有机酸的测定》，乙酸和草酸的测定采用离子色谱法；抗氧化活性测定：总抗氧化能力测定采用总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）测定试剂盒、羟自由基清除能力采用羟自由基测定试剂盒。

2 结果与分析

2.1 单一澄清剂的筛选

图1 不同澄清剂对南瓜醋的澄清效果Fig.1 Effect of different clarifying agents on clarification effect of pumpkin vinegar

由图1可知，5种澄清剂中壳聚糖和明胶的澄清效果较好，在添加量相对较小的情况下，澄清样品也具有较高的透光率。壳聚糖较优的添加量为2%，此时南瓜醋透光率为89.3%，明胶较优的添加量为4%，此时南瓜醋的透光率为92.1%。其余几种澄清剂虽然澄清效果与这两种相差不大，但是添加量间相对较大，可能会对南瓜醋的风味等产生较多不良影响，因此，选择壳聚糖和明胶两种澄清剂复配进一步探究南瓜醋澄清工艺。

2.2 复配比例对澄清效果的影响

由图2可知，随着壳聚糖和明胶体积比的变化，透光率呈现先上升后下降的趋势，壳聚糖和明胶体积比为1∶5～2∶5时，透光率呈现上升趋势；在壳聚糖和明胶体积比为2∶5时，澄清效果最佳，透光率达到97.1%；壳聚糖和明胶体积比为2∶5～1∶1时，透光率呈现下降趋势。可能由于壳聚糖和明胶体积比为2∶5左右时，澄清剂引起的絮凝效果最佳，复配带来的“架桥”作用达到最佳的效果[16]。因此，壳聚糖和明胶最佳体积比为2∶5。

图2 壳聚糖和明胶体积比对澄清效果的影响Fig.2 Effect of volume ratio of chitosan to gelatin on clarification effect

2.3 静置温度对澄清效果的影响

图3 静置温度对澄清效果的影响Fig.3 Effect of standing temperature on clarification effect

由图3可知，随着静置温度在5～45℃范围内升高，透光率呈现先上升后降低的趋势，静置温度在5～25℃范围内升高，透光率呈现先上升趋势；静置温度为25℃时为最佳，透光率可达95.3%；静置温度高于25℃之后，透光率呈现下降趋势。因此，最佳静置温度为25℃。

2.4 静置时间对澄清效果的影响

图4 静置时间对澄清效果的影响Fig.4 Effect of standing time on clarification effect

由图4可知，透光率随着静置时间的延长呈现先略微上升后下降趋于稳定的趋势，静置时间在2～4 h时，透光率随着静置时间的延长而增大；静置时间为4 h时，透光率达到最高，为94.5%左右；静置时间＞4 h之后，透光率随着静置时间而下降。因此，选择最佳静置时间为4 h。

2.5 南瓜醋澄清工艺优化正交试验设计及结果

在单因素试验的基础上，选择壳聚糖和明胶体积比、静置温度和静置时间3个因素，进行正交试验。正交试验的结果与分析见表1。

表1 南瓜醋澄清工艺优化正交试验结果与分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for clarification technology optimization of pumpkin vinegar

由表1可知，根据R值大小，得出因素影响的主次顺序RB＞RC＞RA，静置温度＞静置时间＞壳聚糖和明胶体积比。正交试验的最优组合为A1B2C2，即壳聚糖和明胶比例1∶5，静置温度25℃，静置时间4 h。在此优化澄清工艺条件下，其透光率可达（93.1±1.2）%。

2.6 产品品质指标测定分析

2.6.1 南瓜醋与南瓜浆中总酸和有机酸组成

表2 南瓜醋与南瓜浆中有机酸种类及含量Table 2 Types and contents of organic acids in pumpkin vinegar and pumpkin pulp g/L

由表2可知，南瓜醋总酸含量为52.1 g/L，达到农业部行业标准NYT 2987—2016《绿色食品果醋饮料》中规定的总酸含量标准（≥3 g/kg）。与酶解南瓜浆相比，南瓜醋中有机酸的种类和含量整体都有不同程度的改变，这可能是由于发酵过程中，原料中的部分有机酸被酿酒酵母、醋杆菌和嗜酸乳杆菌等微生物利用生成新的有机酸[17]。如酒石酸在乳酸菌作用下可能降解为乳酸和乙酸，酿酒酵母作用于果蔬汁会生成一些柠檬酸，但柠檬酸又容易在乳酸菌的作用下被大量消耗生成醋酸[18]。琥珀酸绝大部分源于酒精发酵过程中糖类物质发酵后的产物。

有机酸的含量及其各自独特的味道是构成果醋独特酸味味感的主要因素[19]。琥珀酸鲜味比较突出，苹果酸清爽稍带湿味，这些有机酸的味道可以调节乙酸强烈的刺激，从而使果醋的酸味更加平和、醇厚。复合菌株发酵得到的南瓜果醋有机酸种类丰富，其中乙酸和乳酸含量最高，草酸也可作为主体有机酸的一部分，另外还含有柠檬酸、琥珀酸、富马酸等。醋的酸味质量、缓冲性及酸度与有机酸的种类、含量组成和相互比例有直接关系，乙酸口感上刺激性较大，乳酸相对口感醇厚柔和；琥珀酸鲜味比较突出，但了略带香味可以缓冲乙酸的刺激性。有机酸含量取决于发酵原料的糖和稀释乙醇的浓度，与其特有的味道构成果醋独特的味感。

2.6.2 南瓜醋的抗氧化能力

图5 不同种类醋样品的总抗氧化能力（A）及抑制羟自由基能力（B）Fig.5 Total antioxidant capability(A)and hydroxyl radicals scavenging capability(B)of different kinds of vinegar samples

食醋产品都具有一定的抗氧化能力，将南瓜醋与市售的米醋、苹果醋的总抗氧化能力和抑制羟自由基的能力进行了比较。由图5可知，南瓜醋的总抗氧化能力（1.3 U/mL）和羟基自由基清除能力（71%）低于苹果醋，但高于市售的米醋。可能是由于发酵底物不同，发酵液中的抗氧化物的种类和含量不同，导致了各种食醋的抗氧化能力有一定的差异。孙璐宏等[20]研究柿果醋生产过程中抗氧化性能变化，发现柿果醋对DPPH自由基的清除能力在陈酿结束时可达到51.89%；王志煌[21]以椰枣为原料制作果醋，当浓度为8%时，椰枣果醋对DPPH自由基的清除达到97%；此外，市售的食醋大多经过严格的澄清杀菌等工艺，也会造成一些抗氧化物质的损失。

3 结论

本研究以复合菌株发酵南瓜醋，选择酿酒酵母、巴氏醋杆菌沪酿1.01和嗜酸乳杆菌3种菌株，以壳聚糖和明胶复配比例、静置温度和静置时间为探究因素进行单因素试验，采用正交试验设计优化澄清工艺参数。结果表明，最佳澄清工艺条件为壳聚糖和明胶体积比1∶5，静置温度25℃，静置时间4 h。在此优化条件下，南瓜醋透光率为（93.1±1.2）%。制得的南瓜醋产品总酸含量52.1 g/L，包含丰富的有机酸种类，其中乙酸和乳酸含量最高，分别为3.0 g/L和0.49 g/L，总抗氧化能力和羟基自由基清除率分别可达1.3 U/mL、71%，表现出了良好的体外抗氧化活性，且表现出了良好的体外抗氧化活性。