王泽永

摘 要：目的：对祁山药中的多酚类物质进行提取，确定最佳提取工艺（料液比、提取温度、提取时间、丙酮体积分数），并对提取液中的祁山药多酚用Folin_Ciocalteu（福林酚）试剂比色法进行含量测定。方法：通过单因素试验法（料液比、丙酮的体积分数、提取时间和温度的变化）来确定提取祁山药中多酚时每个因素的最佳提取条件，再用正交试验法来确定提取山药中多酚时的提取条件的最优组合。结果：祁山药多酚的最优提取工艺：提取溶剂用体积分数为50%的丙酮，料液比1∶20，提取时间80min，提取温度55℃。结论：试验方法简便、操作简单、准确度高，能够用来测定祁山药以及其他所含多酚类物质的植物中的多酚含量，并且还能为山药多酚的深入研究和综合开发利用提供理论依据。

关键词：祁山药；多酚；提取；Folin_Ciocalteu试剂比色法；正交试验

中图分类号 TQ464 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）14-0013-04

The Extraction and Determination of Polyphenol in Chinese Dioscorea opposita Thunb.

Wang Zeyong

（Agricultural College of Hebei Agricultural University，Baoding 071000，China）

Abstract：Objective：In order to extract the polyphenols in Chinese Dioscorea opposita Thunb，and determine the optimal extraction process （liquid ratio，extraction temperature，extraction time，and acetone volume fraction）. The content of polyphenols in the extracted liquid was measured by Folin_Ciocalteu（forinol） reagent colorimetry. Method：The optimal extraction conditions of polyphenols from Chinese Dioscorea opposita Thunb were determined by single factor test （ratio of liquid to material，volume fraction of acetone，extraction time and temperature change）. Orthogonal test was used to determine the optimal combination of extraction conditions for polyphenol extraction from Chinese Dioscorea opposita Thunb. Result：The optimum extraction process of polyphenols from Chinese Dioscorea opposita Thunb was determined by this experiment. The liquid to liquid ratio is 1∶20. The extraction time is 80 minutes；Extraction temperature was 55℃. Conclusion： The test method is simple，the operation is simple，high accuracy，can be used to determination of yam and other polyphenols contained polyphenols content in plants，and also for the further research of Chinese Dioscorea opposita Thunb polyphenols and provide theoretical basis for comprehensive development and utilization.

Key words：Dioscorea opposita Thunb；polyphenols；extract；Folin_Ciocalteu reagent colorimetry；Orthogonal test

祁山藥，为产自河北安国的山药统称，品种有“小白嘴、棒药、紫药”，是八大祁药之一，为薯蓣科薯蓣属植物薯蓣的干燥块茎。祁山药多分布在我国华北、西北及长江流域的江西、湖南等地[1]，其性平、味甘，具有健脾、固肾和益肺等功效，是我国传统的药食同源类植物，具有很高的营养价值、药用价值和经济价值。明代医药学家李时珍在《本草纲目》中将山药的功效总结为“益肾气，健脾胃，止泄痢，化痰涎，润皮毛”5个方面[2]。这与山药中所含有的多酚类化合物这一抗氧化活性物质有一定的关系，它具有抗氧化、抗衰老、增强免疫等功能[3]。目前，有关山药多酚的研究，无论是国内还是国外都比较少，主要集中在对山药多糖的研究[4-5]。本试验以祁山药为试验对象，用丙酮作为提取溶剂，探索山药多酚的最佳提取条件，以期为山药的深入研究及开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 祁山药为在安国药材市场所买的山药品种“小白嘴”。

1.1.2 主要试剂 没食子酸标准品，成都曼斯特生物科技有限公司；丙酮、无水碳酸钠，均为国产分析纯；Folin_Ciocalteu（福林酚）试剂。

1.1.3 主要仪器 TDZ4-WS低速台式离心机，赛特湘仪离心机仪器有限公司；仪表恒温水浴锅，上海树立仪器仪表有限公司；DHG-9240A電热恒温鼓风干燥箱，北京陆希科技有限公司；四两装高速万能粉碎机，浙江屹立工贸有限公司；UH5300紫外分光光度计，天美（中国）科学仪器有限公司；比色皿、容量瓶（10、50mL）、烧杯、离心管、电子分析天平等。

1.2 方法

1.2.1 试验材料处理 首先称取一定量的祁山药，将山药用水冲洗，除去附着在表面的泥沙，然后用小刀轻轻将皮去掉，切成厚薄大致均匀的薄片状，将其放入电热恒温鼓风干燥箱中45℃烘干至恒重，再用高速万能粉碎机粉碎后放入干燥器中备用。

1.2.2 山药多酚的提取 在备用的干燥器中准确称取3g祁山药粉末，在设定的各种条件下提取多酚，然后用滤纸过滤掉所剩残渣，把滤液放置于离心管中，在放于低速离心机中离心，设定离心条件为转速为4000r/min，等待10min，取出离心管，用移液管准确称量一定量的上清液与50mL容量瓶中，并加入蒸馏水定容至刻度。

1.3 单因素试验法

1.3.1 丙酮体积分数 用天平准确称取3g祁山药粉末，然后放置于带有不同标记的烧杯中，固定料液比为1：20（m/v），在55℃的恒温水浴锅中，用体积分数为40%的丙酮溶液提取100min，然后再用不同体积分数（50%、60%、70%、80%）的丙酮溶液提取，以上清液中的多酚含量为指标，分析提取山药多酚时所需最适丙酮体积分数，确定最佳提取工艺。

1.3.2 料液比 用天平准确称取3g祁山药粉末，然后放置于带有不同标记的烧杯中，选用体积分数为50%的丙酮作为提取溶剂，选取的料液比分别是1∶15、1∶17.5、

1∶20、1∶22.5、1∶25，在55℃恒温水浴锅加热提取100min，以山药提取液中提取出来的上清液中的多酚含量作为评价指标，分析提取山药多酚时所需的最适料液比，确定最适提取山药多酚的条件。

1.3.3 提取温度 用天平准确称取3g山药粉末置于带有不同标记的烧杯中，固定料液比为1∶20，在恒温水浴锅中用体积分数为50%的丙酮溶液提取，水浴温度从35℃到75℃变化，每升高10℃提取1次，每次用水浴加热提取100min，以山药提取液中提取出来的上清液中的多酚含量作为评价指标，分析提取山药多酚时所需的最适提取温度，确定最佳提取工艺。

1.3.4 提取时间 用天平准确称取3g山药粉末置于带有1-5号标记的烧杯中，固定料液比为1∶20，在温度为55℃的恒温水浴锅中提取，提取溶剂用体积分数为50%的丙酮溶液，1号烧杯提取40min，2号烧杯提取60min，依次增加20min，直到5号烧杯提取120min，然后依次取出静置，以山药提取液中提取出来的上清液中的多酚含量作为评价指标，分析提取山药多酚时所需的最适提取时间，确定最佳提取工艺。

1.4 正交试验法 正确分析每个单因素对提取山药多酚的影响后，用正交试验法优选出提取山药多酚的最佳提取条件，在上述影响提取多酚的单因素选择3个（料液比、时间和温度），每个影响因素分别设置3个水平，按照L9（33）正交表的试验设计，如表1所示，将提取液置于离心管中离心，取一定量上清液，定容于50mL容量瓶中，用以测定山药中的多酚含量。

1.5.1 标准品溶液的配制 首先精确称取5.000mg干燥的没食子酸标准品于小烧杯中，加入蒸馏水使其溶解，然后将溶解后的溶液转移至50mL的容量瓶中，用蒸馏水润洗2遍烧杯，将润洗后的溶液都转移至容量瓶中，再加入蒸馏水定容至刻度，就可以配制成100mg/L的标准溶液。

1.5.2 绘制没食子酸的标准曲线 首先用移液管准确称取质量浓度为100mg8L的没食子酸标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，然后再分别置于规格为10mL的容量瓶中，并作上数字标记，在每个容量瓶中分别加入Folin_Ciocalteu试剂2.0mL，然后再分别加入由无水碳酸钠配制而成的10%的碳酸钠溶液2.0mL，摇匀静置后，再往容量瓶中加入蒸馏水至刻度下面，再用胶头滴管定容至刻度，然后再在30℃的恒温水浴锅中加热反应1h后，在设定波长为765nm的条件下，用UH5300紫外分光光度计测定提取液的吸光度值，并且作试剂空白对照。以没食子酸质量浓度（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐轴，制作标准曲线。通过对原始数据的处理分析，并采用二元线性回归法得到1个线性回归方程为：

y=0.1613x+0.0343，r=0.9996

试验结果表明，没食子酸的质量浓度在0～8mg/L的范围内与其吸光度值呈良好的线性关系。

1.5.3 多酚含量的测定 用移液管精确吸取山药多酚提取液2.0mL、Folin_Ciocalteu试剂2.0mL、10%碳酸钠4.0mL于10mL容量瓶中，充分震荡、摇匀，再加蒸馏水定容至刻度后，于30℃的恒温水浴锅中加热反应1h，在设定波长为765nm的条件下，用UH5300紫外分光光度计测定多酚提取液的吸光度值，并且再用只加试剂不加样品的对照组作空白对照，记录下测得的吸光度值，然后将得到的数值代入上述由标准品测得的线性回归方程中去，通过计算得出山药提取液中的多酚含量，以此来确定山药最佳提取的条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 山药提取液中的多酚含量受丙酮体积分数的影响 由图1可知，多酚含量呈先上升，后下降的趋势，表示丙酮的体积分数不断增大（40%～80%），在山药中提取出来的多酚含量也随之变化，即先增多后减少，并且当用体积分数为50%的丙酮溶液提取山药中的多酚时，此时测得的提取液中的吸光度值为最高，即多酚含量达到最大，所以，提取溶剂用50%的丙酮提取最佳。

2.1.2 山药提取液中的多酚含量受料液比的影响 由图2可知，随着料液比的不断增大，山药提取液中的多酚含量逐渐上升，当上升到一定值时趋于平缓，所用的料液比为1∶22.5时，山药提取液中的多酚含量在此实验中最高，但与料液比为1∶20时的数值几乎并无差别，折线几乎趋于平缓，综合各种因素考虑，提取山药中多酚时，所采用的最佳料液比为1∶20。

2.1.3 山药提取液中的多酚含量受提取温度的影响 由图3可知，多酚含量呈上升下降又升高趋势，表示用35～55℃的温度提取山药中的多酚时，提取出来的多酚是越来越多，在55℃时达到最高，然后再增加温度提取出的多酚逐渐减少，虽然最后有所上升，但都远少于在55℃时所提取的含量值，所以55℃为最适温度。

2.1.4 山药提取液中的多酚含量受提取时间的影响 由图4可知，多酚含量呈先上升后下降的趋势，表示在恒温水浴锅中提取多酚时，提取时间在80min之前，时间越多，提取的多酚越多，之后含量逐渐减少。因此，山药中的多酚最佳提取时间为80min。

2.2 正交试验结果的分析 根据正交试验表1进行的试验，得出的数据分析结果如表2所示，通过观察表2中的R值可知，B因素即提取温度对从山药中提取出来的多酚含量影响最大，C因素即提取时间的影响较温度的影响小，而A因素即料液比对山药中多酚的提取的影响最小。且通过观察R值可知，A、B、C 3个因素中的最佳水平即最适提取条件为A2B3C1，即料液比為1∶20，提取温度为55℃，提取时间为80min。

3 结论与讨论

多酚是分子中具有多个羟基酚类成分的总称，是广泛存在于植物体内的重要次级代谢产物[7]，具有抗氧化、抗衰老、健脾益肺等药理功效。本试验通过单因素试验法和正交试验法优选出来的最佳提取组合为：提取溶剂用体积分数为50%的丙酮，料液比1∶20，提取时间80min，提取温度55℃，在此条件下提取出来的多酚最多。

测定山药中多酚含量的方法有多种，除了本试验所用的福林酚试剂比色法以外，还有普鲁士蓝（PB）法测定多酚含量[8]。但用普鲁士蓝法测定时，测得的多酚含量值不稳定，误差较用福林酚试剂法大，而用福林酚法测定时，不仅稳定时间长，而且简单易行，准确度高。另外，提取溶剂的选择也有多种，除丙酮-水溶剂可以有效提取多酚以外，还可以用乙醇来提取，多酚不仅易溶于乙醇，而且乙醇的沸点低，易回收，且不与其他试剂反应，可以按照本试验的方法来确定用乙醇作为提取溶剂时的最佳体积分数。

参考文献

[1]冯学锋，黄璐琦，格小光，等.山药道地药材形成源流考[J].中国中药杂志，2008，33（7）：859-862.

[2]明·李时珍，著.本草纲目[M].北京：中国中医学出版社，1998.

[3]初乐，赵岩，和法涛，等.山药多酚的功能及开发应用展望[J].中国果菜，2013，1：45-46.

[4]乔善义，王立岩，赵毅民，等.山药多糖的提取分离和结构测定[J].中国天然药物，2003，1（3）：155-157.

[5]李凤，成道梅，金虹，等.铁棍LU药水溶性粗多糖的提取工艺研究[J].安徽农业科学，2008（11）：201-202.

[6]程云环、滕井通、薛建平，等.Folin-Ciocalteu比色法测定怀山药零余子多酚含量的研究[J].赤峰学院学报，2013（29）：17-19.

[7]赵扬帆，郑宝东.植物多酚类物质及其功能学研究进展[J].福建轻纺，2006，18（11）：107-109.

[8]王勇，史会齐，李明静，等.山药及其同属植物参薯中多酚含量的测定[J].河南大学学报，2005，35（4）：41-44. （责编：张宏民）