李燕，王吉先，赵新卫，刘军

(青岛西海岸新区中心医院，山东青岛266555)

骨骼肌缺血/再灌注(I/R)损伤是临床常见的病理生理过程，常见于断肢(指)再植、骨筋膜间室综合征、四肢大血管损伤等血流重建后，轻者可引起骨骼肌局部损伤，重者可导致肢体坏死，甚至危及生命。骨骼肌I/R损伤的发生机制迄今尚未完全阐明。肌浆网是细胞内Ca2+的贮库，其功能是参与肌肉兴奋收缩偶联并维持肌细胞胞质Ca2+稳态。目前认为，骨骼肌细胞内Ca2+超载及肌浆网功能障碍是骨骼肌I/R损伤发生的重要环节。牛磺酸是神经、肌肉、腺体等可兴奋组织内含量最丰富的自由氨基酸，具有调节细胞内Ca2+稳态、清除氧自由基、抑制膜脂质过氧化等多种生物学功能[1]。以往研究证实，牛磺酸对I/R导致的大鼠心、脑组织以及骨骼肌损伤有确切防治作用[2～5]。2014年6月～2015年8月，我们观察了牛磺酸对大鼠I/R损伤时骨骼肌肌浆网功能的影响，并探讨其防治骨骼肌I/R损伤的可能机制。现报告如下。

1 材料

实验动物：雄性Wistar大鼠18只，SPF级，10周龄，体质量336～350 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，动物许可证号：SYXK(京)2011-0039。所有大鼠分笼饲养，自由摄食饮水，环境温度20～25 ℃、湿度(50±5)%，光照12 h明暗交替。主要仪器：QuantulusTMGCT 6220液体闪烁计数仪，美国Perkin Elmer公司；Optima XPN低温超速离心机，美国Beckman Coulter公司，MultiskanTMFC酶标仪、Evolution 600紫外-可见分光光度，美国Thermo Fisher Scientific公司。PMSF、Leupeptin、A23187、PEP、Caffeine、Ryanodine，美国Sigma公司；3H-Ryanodine，美国NEN DuPout公司；45CaCl2，英国Amersham公司。其余试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.2 骨骼肌I/R损伤模型制备及牛磺酸干预 所有大鼠适应性饲养1周，随机分为对照组、模型组、牛碱酸组，每组6只。模型组、牛磺酸组参照Lamboley等[6]的方法建立骨骼肌I/R模型：术前禁食12 h，戊巴比妥钠60 mg/kg腹腔注射麻醉，用止血带扎紧双后肢根部以阻断血流2 h，松开止血带恢复血流2 h。牛磺酸组制模前30 min经左颈外静脉注射0.6 mol/L的牛磺酸1.5 mL/kg，模型组经左颈外静脉注射生理盐水1.5 mL/kg。对照组仅经左颈外静脉注射生理盐水1.5 mL/kg，不制备骨骼肌I/R损伤模型。

2.3 牛磺酸对骨骼肌I/R损伤大鼠组织水肿及氧化应激相关指标的影响 模型组与牛磺酸组再灌注2 h，对照组同时间，腹腔注射麻醉后，完整分离左侧股内侧肌群，切取一半称湿重，90 ℃彻底干燥后称干重，计算湿重/干重，以此反映组织水肿情况。取另一半左侧股内侧肌群，用预冷生理盐水制成10%肌组织匀浆，分别采用硫代巴比妥酸法检测脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量，化学比色法检测髓过氧化物酶(MPO)活性，以此评估骨骼肌I/R后氧化应激反应情况。结果显示，模型组与牛磺酸组骨骼肌湿重/干重及MDA含量、MPO活性均明显高于对照组，但牛磺酸组上述指标均明显低于模型组(P均<0.01)。结果见表1。

表1 各组骨骼肌湿重/干重及氧化应激损伤相关指标比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。

2.4 牛磺酸对骨骼肌I/R损伤大鼠肌浆网功能影响的观察

2.4.1 骨骼肌肌浆网制备 参照McGrew等[7]的方法制备骨骼肌肌浆网。分离各组双侧腓肠肌和比目鱼肌，0～4 ℃生理盐水冲洗，加入7.5倍体积的Buffer A(含20 mmol/L焦磷酸钠，20 mmol/L PBS，1 mmol/L MgCl2，0.303 mol/L蔗糖，0.5 mmol/L EDTA，76.8 nmo1/L aprotinin，1.1 μmol/L Leupeptin、0.23 mmol/L PMSF)，冰浴中剪碎肌肉组织，Polytron匀浆器中匀浆，1 000 r/min离心15 min，上清液经纱布过滤，沉淀再复溶于5倍体积的Buffer A中，重复上述过程，合并2次滤液，16 000 r/min离心30 min，弃上清，沉淀用5倍体积的Buffer C(含0.6 mol/L KCl，0.303 mol/L蔗糖，pH 7.0)重悬，冰上孵育30 min，45 000 r/min离心30 min，弃上清，沉淀即为骨骼肌肌浆网。

2.4.2 牛磺酸对肌浆网Ca2+-ATPase活性的影响 参照Fauconnier等[8]的方法检测Ca2+-ATPase活性。分别取三组上述制备的肌浆网50 μg，加入Ca2+-ATPase活性反应液(A溶液：50.0 mmol/L Histidine，5 mmol/L MgCl2，111 mmol/L KCl，0.001 mmol/L CaCl2；B溶液：50.0 mmol/L Histidine，5 mmol/L MgCl2，111 mmol/L KCl，1.1 mmol/L EDTA，3.3 μg/mL A23187；使用前A溶液与B溶液1∶1混合，再加入新鲜配置的3.33 mmol/L PEP和15 U/mL PK)1 mL，37 ℃孵育10 min，加入ATP溶液0.1 mL(30 mmol/L Na2-ATP)启动反应，37 ℃孵育20 min终止反应。采用定磷法检测肌浆网Ca2+-ATPase活性。计算Ca2+-ATPase活性=样品磷(Pi)含量/(反应蛋白量×反应时间×1 000)。结果显示，对照组肌浆网Ca2+-ATPase活性为(2.24±0.13)μmol Pi/(mg protein·min)，模型组为(1.35±0.16)μmol Pi/(mg protein·min)，牛磺酸组为(1.79±0.23)μmol Pi/(mg protein·min)。模型组与牛磺酸组肌浆网Ca2+-ATPase活性均明显低于对照组，但牛磺酸组肌浆网Ca2+-ATPase活性明显高于模型组(P均<0.01)。

2.4.3 牛磺酸对肌浆网3H-Ryanodine受体结合的影响 采用同位素标记法。取三组上述制备的肌浆网150 μg，加入结合缓冲液(含1 mol/L KCl，25 μmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES，pH 7.4)，调整体积至180 μL，再加入10 nmol/L3H-Ryanodine 20 μL，总体积200 μL。非特异性配体结合管的孵育液含50 μmol/L未标记的Ryanodine 20 μL，37 ℃孵育2 h，用预冷的缓冲液冲洗3次终止反应，Millipore抽滤后，将滤膜干燥，置于2 mL闪烁液中。采用液体闪烁计数仪检测3H-Ryandine的配体-受体最大结合量(Bmax)以及解离常数(Kd)。结果显示，模型组与牛磺酸组肌浆网3H-Ryandine配体-受体的Bmax均明显低于对照组，Kd均明显高于对照组(P均<0.01)；但牛磺酸组肌浆网3H-Ryandine配体-受体的Bmax明显高于模型组，Kd明显低于模型组(P均<0.01)。见表2。

表2 各组肌浆网3H-Ryandine配体-受体Bmax、Kd比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。

2.4.4 牛磺酸对肌浆网45Ca2+摄取能力的影响 采用同位素标记法。取三组上述制备的肌浆网120 μg，加入Ca2+摄取反应液(含0.1 mmol/L KCl，5 mmol/L MgCl2，50 μmol/L CaCl2，20 mmol/L HEPES，pH 7.1)120 μL，再加入45CaCl23.7 kBq，总反应体系200 μL，混匀后加入500 mmol/L Na2-ATP 2 μL，37 ℃孵育30 min，加入冷冲洗液(含0.1 mol/L KCl，0.6 mol/L Tris-HCl，pH 7.2)混匀，2 min后终止反应。在Millipore上抽滤到0.45 μm滤膜上，取出滤膜干燥，置于闪烁液中。参照Fauconnier等[8]的方法，采用液体闪烁计数仪检测45Ca2+的放射活性，并换算成肌浆网45Ca2+摄取量。结果显示，对照组肌浆网45Ca2+摄入量为(0.74±0.10)nmol/mg protein，模型组为(0.53±0.05)nmol/mg protein，牛磺酸组为(0.60±0.04)nmol/mg protein。模型组与牛磺酸组肌浆网45Ca2+摄入量均明显低于对照组(P均<0.01)；但牛磺酸组肌浆网45Ca2+摄入量明显高于模型组(P<0.05)。

2.4.5 牛磺酸对肌浆网45Ca2+释放能力的影响 采用同位素标记法。取三组上述制备的的肌浆网120 μg，按照2.4.4方法加入Ca2+摄取反应液，37 ℃孵育30 min，12 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用PBS洗涤后，加入Ca2+释放液(含80 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L caffeine，pH 6.8)400 μL，分别于1、3、5 min各取100 μL，采用液体闪烁计数仪检测45Ca2+的放射活性，并换算成骨骼肌肌浆网45Ca2+释放量。结果显示，三组加入反应液1 min时45Ca2+释放速度比较无明显统计学差异(P均>0.05)；模型组与牛磺酸组加入反应液3、5 min时45Ca2+释放量均明显低于对照组(P均<0.01)，但牛磺酸组45Ca2+释放量明显高于模型组(P均<0.01)。见表3。

表3 各组肌浆网45Ca2+释放量比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。

3 讨论

细胞内钙超载是I/R损伤发生的重要机制。当I/R发生时，细胞膜上Ca2+泵以及Na+/Ca2+交换体活性异常导致细胞内Ca2+超载，引起细胞功能和结构受损。肌浆网作为细胞内Ca2+的贮库，其功能是参与肌肉兴奋收缩偶联并参与维持肌细胞胞质Ca2+稳态，Ca2+稳态主要通过调节Ca2+的摄取与释放而实现[5，6]。Ca2+的摄取由Ca2+泵(Ca2+-ATPase)的活性决定，而Ca2+的释放则与肌浆网上存在的一种特定Ca2+释放通道Ryanodine受体有关。Ryanodine受体可介导肌肉兴奋-收缩偶联过程中Ca2+的释放[7]。已有研究显示，I/R损伤导致肌浆网Ca2+的摄取与释放异常,改善肌浆网功能可起到缓解I/R损伤的作用[9,10]，进一步研究发现，肌浆网Ryanodine受体缺陷是心肌I/R过程中Ca2+超载的重要原因[8,11]。

牛磺酸是一种β-氨基酸，其性质稳定，在体内由蛋氨酸代谢生成，在骨骼肌和心肌中含量比较丰富。研究证实，牛磺酸具有调节渗透压、抗细胞凋亡、调节膜稳定性、调节氧化应激、参与离子跨膜转运以及参与线粒体蛋白合成等多种生物学功能[1,2,12]。牛磺酸不仅可拮抗I/R引起的心肌细胞凋亡、脂质过氧化，降低I/R引起的心律失常，还可稳定线粒体膜电位、抑制线粒体损伤[13～15]。目前认为，牛磺酸主要通过激活Akt或PKCε信号通路启动对I/R损伤的拮抗作用，同时通过促进eNOS表达及磷酸化促进NO生成，拮抗I/R损伤[1]。

I/R所致组织损伤的一个典型变化是组织淤血水肿。骨骼肌湿重/干重可反映I/R后组织淤血水肿情况。本研究结果显示，模型组骨骼肌出现明显淤血水肿，而牛磺酸组淤血水肿减轻，证实外源性牛磺酸可减轻骨骼肌I/R损伤。引起组织I/R损伤的机制多与氧化应激反应有关，故本研究观察了骨骼肌组织MDA含量和MPO活性。结果显示，模型组与牛磺酸组骨骼肌MDA含量和MPO活性均明显高于对照组，而牛磺酸组MDA含量和MPO活性明显低于模型组，提示骨骼肌I/R后出现了明显的氧化应激反应，而牛磺酸能明显抑制脂质过氧化物引起的氧化应激损伤，与其对心肌I/R损伤的保护效应一致。为进一步探索牛磺酸的保护机制，本研究观察了大鼠骨骼肌肌浆网对Ca2+摄取和释放的影响。结果显示，模型组肌浆网45Ca2+摄入量和45Ca2+释放量均明显低于对照组，而牛磺酸组明显优于模型组，说明牛磺酸可改善肌浆网Ca2+摄取和释放的功能，从而减轻细胞内Ca2+稳态失衡，减轻I/R损伤。进一步研究显示，模型组3H-Ryandine配体-受体的Bmax显著减少，而配体-受体的Kd明显增加，牛磺酸组上述指标均有一定程度改善，提示骨骼肌I/R损伤后肌浆网RyR通道异常，导致肌浆网Ca2+摄取和释放平衡被破坏，从而影响骨骼肌兴奋收缩偶联，导致骨骼肌功能障碍；而牛磺酸通过促进I/R损伤时肌浆网Ca2+-ATPase的活性，增加Ca2+摄取，同时也可增加Ryandine受体通道活性，提高Ca2+释放速度而调节细胞内Ca2+平衡。已有文献证实，牛磺酸的代谢产物牛黄胆酸也可作用于Ca2+泵，促进Ca2+回收，调节细胞内Ca2+水平；牛磺酸及其代谢产物还可通过直接激活Ryanodine受体而保护骨骼肌兴奋收缩偶联的正常运转，恢复骨骼肌的收缩功能[16]。

综上所述，牛磺酸对大鼠骨骼肌I/R损伤具有一定防治作用，其机制可能与抑制氧化应激反应以及调节肌浆网Ca2+稳态有关。