张丽红，邓子淳，方 佳，李兰洲，刘 艳*

（1. 吉林大学 基础医学院，长春 130021；2. 吉林大学 生命科学学院，长春 130012）

痛风是一种常见的代谢相关的关节炎疾病，高尿酸血症通常被认为是痛风发生的重要生理基础。抗痛风药物主要可分为两类，一类是抗痛风性关节炎药物[1]，另一类是抗高尿酸血症药物[2]。但是目前市场上的药物效果单一且均具有不同程度的不良反应[3-4]。

异落新妇苷（isoastilbin，IA）是一种二氢黄酮醇苷类化合物，研究证明IA在抗氧化方面显示有较好效果[5]。IA在土茯苓、黄芪等中药中广泛分布[6-7]，已有研究显示，土茯苓在抗痛风性关节炎和抗高尿酸血症方面均显示出了较好的效果[8-9]。

本文建立了痛风性关节炎大鼠模型和高尿酸血症小鼠模型，通过对大鼠关节肿胀变化，炎症因子水平变化及小鼠血尿酸水平和黄嘌呤氧化酶活性变化，对异落新妇苷的抗痛风活性进行研究，并对异落新妇苷抗痛风机制进行讨论。

1 实验材料

雄性昆明小鼠，体质量20～22 g，购自长春生物制品研究所，许可证号：SCXK-（吉）2014-0005；雄性SD大鼠，质量180～200 g，购自长春生物制品研究所，许可证号：SCXK-（吉）2016-0003。异落新妇苷（IA）和大鼠IL-1β，IL-8，IL-10，MCP-1，IFN-γ，6-Keto-PGF1α，小鼠ROS，SOD，MDA等ELISA试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）；尿酸UA试剂盒和黄嘌呤氧化酶XOD试剂盒（南京建成生物工程研究所）；多聚甲醛，二甲苯，切片石蜡，盐酸，无水乙醇和甲酸（国药集团化学试剂有限公司）；尿酸钠，氧嗪酸钾（SIGMA集团）；秋水仙碱片（云南植物药业有限公司）；别嘌呤醇片（世贸天阶制药（江苏）有限责任公司）；苏木精，水溶性伊红Y（阿拉丁试剂）。BS224S电子天平（德国Sartorius公司）；可调式微量移液器（德国eppendorf公司）；BD326电冰箱（中国青岛海尔公司）；5810R高速冷冻离心机（德国 Eppendorf公司）；SYNEK GY4型酶标仪（美国伯腾公司）；IX71荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）。

2 方法

2.1 异落新妇苷抗痛风性关节炎活性研究

2.1.1 大鼠痛风性关节炎模型建立及异落新妇苷治疗 50只雄性SD大鼠，随机分为空白对照组，模型组，阳性组，15、45 μg/kg异落新妇苷组，每组10只。阳性组灌胃给药0.3 mg/（kg·d）的秋水仙碱（按照人体剂量换算），异落新妇苷给药组分别灌胃给药相应剂量的异落新妇苷，其余组给予等体积的双蒸水，给药周期为7 d。在第5天给药1 h后，除空白组大鼠，均进行右踝关节腔注射100 µL的30 mg/mL尿酸钠（MSU）悬液，空白组大鼠注射等量生理盐水。第7天给药1 h后立刻收集大鼠血清（- 80 ℃保存）和右踝关节组织（4%多聚甲醛固定，室温保存）备用。

2.1.2 大鼠踝关节肿胀变化测定 绳缚法测量各组大鼠MSU注射后0、4、12、24 h和48 h右踝关节的周长。计算其肿胀度，计算方式如下：

其中，Ct为不同时间点的大鼠关节周长，C0为0 h的大鼠关节周长。

2.1.3 炎症相关因子测定 大鼠炎症因子IL-1β，IL-8，IL-10，MCP-1，IFN-γ，6-Keto-PGF1α 含量测定，取大鼠血清按照上海源叶生物科技有限公司ELISA检测试剂盒要求进行检测。

2.1.4 大鼠踝关节HE染色切片制备和观察 大鼠踝关节经脱钙，石蜡切片后依次进行常规脱蜡复水，苏木素染色5 min，自来水冲洗，盐酸乙醇分化，自来水冲洗，伊红染色2 min，自来水冲洗，乙醇逐级脱水，二甲苯透明1 min，最后用中性树胶进行封片并加盖盖玻片。待树胶完全干后在显微镜下进行病理学观察。

2.2 异落新妇苷抗高尿酸血症活性研究

2.2.1 小鼠高尿酸血症模型建立及异落新妇苷治疗 50只雄性昆明小鼠，随机分为空白对照组、模型组、阳性组、15、45 μg/kg 异落新妇苷组，每组10只。阳性组灌胃给药20 mg/（kg·d）的别嘌呤醇（按照人体剂量换算），异落新妇苷给药组分别灌胃给药相应剂量异落新妇苷，其余组给予等体积的双蒸水，为期7 d。在第5～7天给药1 h后，除空白组外，腹腔注射氧嗪酸钾溶液300 mg/（kg·d），空白组小鼠注射等量生理盐水。末次给药1 h后立刻收集小鼠血清和肝脏（- 80 ℃保存）。

2.2.2 小鼠血清UA测定 利用南京建成生物工程研究所的尿酸（UA）测试盒（酶比色法）（微板法）测定各组小鼠血清中尿酸含量，评价异落新妇苷降血尿酸能力。

2.2.3 小鼠XOD活性测定 小鼠肝脏加入9倍生理盐水，进行机械匀浆，10 000 r/min离心2次，每次5 min取上清得肝脏匀浆。利用南京建成生物工程研究所的黄嘌呤氧化酶（XOD）测试盒（比色法）测定各组小鼠肝脏和血清中XOD活性，评价异落新妇苷对高尿酸血症小鼠体内XOD活性的影响。

2.3 数据处理和分析 选用SPSS 19.00 软件采用ANOVA分析方法对数据进行统计分析。

3 结果

3.1 异落新妇苷对痛风性关节炎大鼠踝关节肿胀的影响 如图1所示，在MSU注射建模4、12、24 h和48 h后，与空白对照组相比，模型组大鼠关节肿胀度均显著增加（P＜0.01），分别增加18.4%，24.5%，24.2%和19.9%，0.3 mg/kg秋水仙碱治疗，在4 h和12 h显示出抑制MSU引起的肿胀（P＜ 0.05），在其他测定时间点缓解肿胀效果不明显。在4、12、48 h时间点，两个剂量的异落新妇苷均显示出显著的缓解大鼠关节肿涨（P＜0.01）的效果，且效果均在5.7%以上。

图 1 IA对大鼠踝关节肿胀的影响

3.2 异落新妇苷对痛风性关节炎大鼠炎症因子的影响 如图2所示，MSU注射显著（P＜0.05）提高了大鼠血清中促炎因子IL-8，MCP-1和6-Keto-PGF1α的水平10.8%，9.67%，19.8%，降低了抗炎因子IL-10水平11.2%。MSU引起大鼠关节肿胀的过程中同时引起了大鼠炎症水平的显著升高。45 μg/kg异落新妇苷治疗后，显著提高了大鼠IL-10的水平8.7%（P＜0.05），并降低了 IL-1β，IL-8，MCP-1，IFN-γ 7.0% 以上（P＜0.05）。15 μg/kg异落新妇苷的治疗仅显著降低了大鼠血清中IL-8的水平（P＜0.05）。

3.3 异落新妇苷对痛风性关节炎大鼠踝关节病理变化的影响 如图3所示，200倍显微镜进行病理学检测，MSU注射不会引起大鼠踝关节骨表面损伤，说明关节肿胀和炎症因子升高的原因不是机械性骨损伤造成的。与空白组相比，模型组大鼠切片中出现了明显的细胞浸润现象，分析其可能是由于炎症而引起的巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润。与模型组相比，秋水仙碱给药大鼠的关节细胞浸润有适当缓解。相似地给予异落新妇苷治疗细胞浸润同样得到缓解，从组织病理学角度看异落新妇苷有助于缓解MSU引起的大鼠关节处炎症细胞浸润现象，证明异落新妇苷给药有助于缓解MSU引起的炎症反应过程。

图 2 IA对大鼠炎症因子的影响

3.4 异落新妇苷对高尿酸血症小鼠血尿酸的影响 如图4所示，氧嗪酸钾作用后小鼠血清尿酸水平显著升高了87.6%（P＜0.01），成功模拟高尿酸血症。别嘌呤醇治疗有效的将小鼠血尿酸水平降低到空白组小鼠的水平，异落新妇苷给药后高尿酸血症小鼠血清中尿酸含量显著降低25.8%以上（P＜0.05），实验结果呈现一定的剂量依赖性。可知异落新妇苷具有与别嘌呤醇相似的降低血尿酸的活性。

3.5 异落新妇苷对高尿酸血症小鼠XOD的影响 如图5所示，经氧嗪酸钾建模的小鼠肝脏中XOD活性显著性升高32.5% （P＜0.05），虽然血清中XOD同样升高了13.2%，但是无显著性（P＞0.05）。别嘌呤醇治疗显著的降低了高尿酸血症小鼠血清和肝脏中黄嘌呤氧化酶活性29.8%以上（P＜0.05），异落新妇苷给药显著的降低了高尿酸小鼠肝脏中黄嘌呤氧化酶活性12.9%以上（P＜0.05）。可知异落新妇苷与别嘌呤醇相似，可以通过降低小鼠黄嘌呤氧化酶活性从而降低血尿酸水平。

图 3 IA对大鼠踝关节组织病理学的影响（200×）

图 4 IA对小鼠血尿酸的影响

图 5 IA对小鼠XOD活性的影响

4 讨论

痛风，又称为痛风性关节炎，发病基础为巨噬细胞吞噬尿酸钠晶体，引起的炎症级联放大并引起痛觉过敏。痛风患者往往在末端关节处形成痛风石，并形成周期性的关节炎发作[10]。目前针对痛风治疗的手段很是有限，病人往往只能通过控制饮食，使用抗炎药物、降尿酸药物进行痛风控制，往往会出现痛风反复发作，并深受药物不良反应影响。且目前临床上的抗痛风药物效果单一，还没有能同时控制痛风性关节炎和高尿酸血症的安全药物。所以开发具有两种效用且安全的天然化合物受到了许多研究者的关注[11]。异落新妇苷作为土茯苓等多种中药中广泛存在的类黄酮物质，其抗痛风性关节炎活性和抗高尿酸血症活性值得期待。

有研究指出，IL-1β是痛风性关节炎发病的重要炎症因子，抑制IL-1β可能是治疗痛风的一种可行策略[12]；IL-8具有促进炎症细胞募集的作用[13]；MCP-1具有诱导趋化性单核细胞的能力，在关节炎中起重要作用[14]。相反，IL-10是一种抗炎细胞因子，在调节免疫应答和抑制巨噬细胞活化中起重要的作用[15-16]。异落新妇苷治疗在缓解MSU引起的关节肿大方面效果显著（P＜0.01），并显著的降低了IL-1β，IL-8，MCP-1，IFN-γ的水平7.0%以上，提高了IL-10水平8.7%。说明了异落新妇苷可以通过调节痛风性关节炎炎症因子，缓解痛风引起的关节肿胀。

一般认为高尿酸血症可能与痛风密切相关，尿酸代谢在急慢性痛风发病中起着关键性作用。直接催化UA产生的XOD的上调和UA代谢所必需的尿酸氧化酶的缺乏，可导致高尿酸血症[17]。XOD在UA生产中起着关键的催化作用[18]。异落新妇苷治疗在降低血尿酸方面显示出了较好效果，45 μg/kg异落新妇苷给药降低血尿酸的效果与别嘌呤醇效果相似，血尿酸水平接近正常小鼠水平。但异落新妇苷给药仅在肝脏中显示出了显著降低XOD活性的效果。推测异落新妇苷可以通过抑制XOD活性降低高尿酸血症小鼠血尿酸的水平。