李雪君，孙计平，娄亚男，平文丽，孙 焕，丁燕芳，崔 红

(1.河南省农业科学院 烟草研究所/黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室,河南 许昌 461000;2.河南农业大学，河南 郑州 450002)

甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate，EMS)是目前公认的应用最广泛且效果较明显的一种高效、稳定的化学诱变剂。EMS诱变不需要遗传转化，可使DNA分子形成较多的点突变，对染色体损伤轻且不容易导致畸变，因而被广泛用于突变体的创造[1]。EMS诱变既是对种质资源的创新，又是挖掘新基因的强有力工具，加速育种进程的同时也推动功能基因组学的发展。近年来，EMS诱变效果的影响因素、后代的筛选与鉴定及其在农作物新品种选育等方面的研究取得了较大进展[2]。目前，EMS诱变在多种作物育种中取得显著成就，如玉米[3]、小麦[4]、水稻[5]、花生[6-7]、芝麻[8]、大豆[9-10]、红小豆[11]、苦荞[12]、茄子[13]等。烟草上通过EMS诱变突变体的研究主要集中在PVY抗性[14]、耐低钾[15-16]、抗干旱[17]、抗主要病虫害突变体材料的鉴定方法[18]等方面，对不同香韵突变材料的筛选研究应用尚未见报道。

香韵是用来描述发香物质或加香制品所带来的某种香气的韵调[19]，烟叶的香韵是指烟叶烟气所表现出的某种香气韵调[20]。目前烟叶中所发现的香韵有干草香、清甜香、正甜香等15种。其中干草香是烤烟本香，其余各香韵在不同香型烟叶中的分布不同[21]。烟叶不同香韵的表现受产地[21-27]、气象[28]、区域环境[29]等因素的影响，但其本质是与烟叶和烟气中的相关香气成分的种类和含量密切相关。每一类香气成分的香韵基本不变，针对不同香气成分含量，筛选不同香韵的株系，对丰富烟草类型具有重要意义。

烟草叶面腺毛具有较强的分泌能力[30]，腺毛分泌物不仅对烟株抗性具有积极作用，与烟叶香气品质和风味形成也密切相关[31]。烟叶腺毛发育状况好、密度高，腺毛分泌物多，其香气饱满、醇厚、浓郁[32]。前期，以腺毛密度为主要指标对中烟100 EMS突变体进行了初步筛选[33]，在此基础上，对EMS诱变材料后代进行特征香气成分研究，以期鉴定出不同香韵的突变材料，为特香型烟草新品系的筛选提供材料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

采用0.8% EMS处理中烟100裸种，处理后的致死率在50%左右。种子正常萌发成苗后，按照优质烟叶栽培规程进行大田种植，单株留种，收获M2代种子2 000余份。对M2代EMS诱变株进行初步的室内筛选，获得了29份腺毛密度相对较高的突变材料，以中烟100为对照(CK)，进行田间种植，进一步做相关指标鉴定。

1.2 试验方法

1.2.1 腺毛密度观测 参照刘贯山等[33]的方法，利用Motic显微镜进行观测。

1.2.2 叶面分泌物的提取检测 参考杨永霞等[34]的方法提取鲜烟叶叶面成分，加入1 mL内标(2.020 mg/mL蔗糖八乙酸酯和2.542 mg/mL正十七烷醇的混合溶液)，旋转蒸发仪浓缩，硅烷化处理后采用GC/MS进行分析。

1.2.3 中性香气成分的提取和检测 提取方法和GC/MS检测参照冀浩等[35]的相关研究。参照李伟等[36]对中性致香物质的分类方法，把33种中性致香物质分为五大类：类胡萝卜素降解产物、棕色化反应产物、苯丙氨酸类降解产物、类西柏烷类降解产物、新植二烯。

2 结果与分析

2.1 EMS诱变后代烟草各株系的腺毛密度

对M2代突变体叶片表面腺毛密度进行统计，发现部分突变株腺毛密度有较大改变，结果如图1所示。腺毛密度高于中烟100(CK)的有27份，其中MC-29、SX-19、MC-67、MC-70、SX-3A、SX-18、MC-8、SX-7等8份材料极显著高于CK，以MC-29最高，达到96.3个/mm2；SX-14、SX-5、SX-11等10份材料显著高于CK，其余材料与CK差异不显著。

2.2 EMS诱变后代烟草各株系的叶面分泌物含量

烟草叶面腺毛丰富，分泌旺盛，腺毛分泌物是烟草叶面化学成分的重要组成部分。烤烟腺毛分泌物主要是西柏烷类二萜化合物、糖脂、烷烃类等，其中，西柏烷类化合物不仅是烟叶重要的香气前体物质，对驱避蚜虫、防御病毒侵袭以及应对干旱、紫外照射等逆境胁迫也有积极作用。由图2可见，SX-3、SX-3A、MC-67、MC-30、MC-1等5份材料的腺毛分泌物中西柏烷类化合物含量较高，较CK均增加100%以上，其中以SX-3的增幅最大，达188.9%。腺毛分泌物中西柏烷类化合物含量低于CK的材料有5份，分别为SX-6、MC-46、SX-5、MC-2、SX-11。其余材料的西柏烷类化合物含量均高于CK，增幅介于0～100%。

叶面腺毛分泌物总量较CK增加100%以上的有SX-3、SX-3A、MC-67，其中以SX-3的增幅最高，达164.45%，SX-3A增幅为143.64%；MC-29、SX-5、MC-46、SX-11和MC-2等5份材料的腺毛分泌物总量低于CK，其余21份材料的腺毛分泌物总量均高于CK，增幅介于0～100%。

*、**分别表示在0.05、0.01水平上的差异显著性

图2 EMS诱变后代烟草不同株系的叶面分泌物含量变化

2.3 EMS诱变后代烟草各株系的中性香气物质含量

2.3.1 中性香气物质总量 烟草香味由多种具有特定香味特征的成分共同决定，而中性致香物质是评价烟叶质量的核心内容，其含量可作为评价烟叶口感特性的参考指标。由图3可见，EMS诱变后代株系的香气物质总量高于CK的仅有9个株系，较为突出的是MC-29、SX-17和SX-19，分别比CK高出51.28%、29.66%和23.26%,其他6个株系的香气物质总量略高于CK；其余20个株系的香气物质总量均低于CK。

图3 EMS诱变后代烟草不同株系中性香气物质总量变化

2.3.2 苯丙氨酸类降解产物 烟草中苯丙氨酸的代谢转化是影响香味的重要过程之一。苯丙氨酸类致香物质可使烟草增加类似花香的香味，其代谢产物苯甲醇、苯乙醇可增加烟气的花香、樱桃香、杏仁香及皂香香味[37]；苯甲醛与苯乙醛可以改善卷烟吃味，与烟香协调、增加烟草的自然风味，具有掩盖杂气刺激的作用[38-39]。由图4可见，不同株系之间苯丙氨酸类降解产物的含量差异较大，大部分材料高于CK，低于CK的有9份材料。MC-70苯丙氨酸类降解产物的总量较CK增加最多，达到94.39%，其次为SX-18，较CK增加78.73%。这2个株系对苯丙氨酸类降解产物含量的提高效果较为明显。此外，MC-9、MC-30、SX-8等3个株系的丙氨酸类降解产物含量较CK提高均达50%以上，也是3个较好的材料。苯甲醛和苯乙醛含量较CK增幅较大的株系为SX-8和SX-17，其中，SX-8分别比CK增加165.87%和195.82%，SX-17分别比CK增加85.86%和155.17%。有21个株系糠醛含量增加，但增加幅度均小于29%。初步认为MC-70、SX-18、SX-8、SX-17这4份材料可以作为类似花香香韵类型的烟草突变材料。

图4 EMS诱变后代烟草不同株系的苯丙氨酸类降解产物含量变化

2.3.3 棕色化反应产物 由图5可见，不同株系之间棕色化反应产物含量差异较大。除7个株系的棕色化反应产物含量低于CK，其余株系的棕色化反应产物含量均高于CK，以SX-7增幅最大，为47.92%，其次是SX-13(41.99%)；SX-8、SX-13的棕色化反应产物中3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮的含量较CK增加非常多，分别达141.21%、124.7%。

图5 EMS诱变后代烟草不同株系的棕色化反应产物含量变化

2.3.4 类胡萝卜素降解产物 类胡萝卜素是烟叶中重要的香气前提物质。Gao等[40]分析认为，浓香型烤烟的特征香气成分可能与类胡萝卜素的降解产物相关。由图6可见，与CK相比，类胡萝卜素降解产物含量增加的材料较多，但增幅基本都在40%以下。SX-8、MC-29、SX-17、SX-13、SX-12等材料的类胡萝卜素降解产物含量增幅相对较高，其中尤以SX-8、MC-29增幅较高，分别达38.69%、38.67%。因此，可以将SX-8、MC-29作为筛选浓香型风格突出的材料。

类胡萝卜素降解产物中的氧化异佛尔酮具有甜味、紫罗兰酮味。SX-14、MC-1等2份材料的氧化异佛尔酮含量较高，较CK分别增加340.23%、232.68%，可以作为紫罗兰酮香韵的突变材料。香叶基丙酮能够增加浓度、青味，该物质含量较CK增加100%以上的材料有4个，分别是SX-8、SX-12、SX-13、MC-8。内酯类一般具有特殊香味，二氢猕猴桃内酯在吸食烟草时可以起到消除刺激性的作用，SX-8和SX-13的二氢猕猴桃内酯含量较CK分别增加132.60%和133.73%。β-环柠檬醛具有甜味，可以增加浓度和刺激。MC-67的β-环柠檬醛含量较CK增加172.96%，其他材料增加很少，大部分较CK降低。

图6 EMS诱变后代烟草不同株系的类胡萝卜素降解产物含量变化

2.3.5 类西柏烷类降解产物 茄酮是类西柏烷类降解产物中十分重要的香气成分，具有青香、草香及甜香，香气较持久，可以与多种香气较好地协调，能赋予烟草醇和的特殊香气[37]。由图7可见，与CK相比，大部分材料的类西柏烷类降解产物含量降低，仅有4个材料较CK增加，其中MC-67、SX-18分别增加65.05%、26.81%，可以作为青香、草香香韵的突变材料。

图7 EMS诱变后代烟草不同株系的类西柏烷类降解产物含量变化

2.3.6 新植二烯 新植二烯为烟叶中重要的萜烯类化合物，其本身不仅具有一定的香气，而且可分解转化形成低分子香味成分，是烟草中重要的香味成分[37]。新植二烯可进一步转化为具有清香气息的低分子香气质量成分，如植物呋喃等，对形成烤烟的清香气息具有积极影响[41]。由图8可见，与CK相比，EMS诱变后代不同株系的新植二烯含量减少的居多，仅有10份材料高于CK，MC-29的新植二烯含量最高，较CK增加57.54%，SX-17和SX-19的新植二烯含量比CK增加20%以上；其他几个株系新植二烯含量高于CK，但与CK相差不大。

通过本研究发现，MC-29是一个比较特殊的材料，其腺毛密度在所有材料中最高，叶面分泌物较低(低于CK)，但新植二烯含量非常高，香气物质总量最高，可以作为高新植二烯含量的突变材料。清香型烟叶主体香韵中清甜香和青香香韵与新植二烯含量呈极显著正相关[42]，MC-29可以作为清香香韵的材料之一。

图8 EMS诱变后代烟草不同株系的新植二烯含量变化

总的来看，MC-29、SX-17、SX-19等3个株系的香气物质含量较高；MC-70、SX-18等2份材料的苯丙氨酸类降解产物含量较高，较CK增加72%以上，是提高苯丙氨酸类降解产物含量很好的材料，MC-9、MC-30的增幅也达到50%以上；MC-67类西柏烷类降解产物含量较CK增加达到60%以上，对提高该类物质含量是很好的材料；SX-7、SX-13棕色化反应产物含量和MC-29新植二烯含量较CK增幅均达40%以上。因此，针对香气物质含量，筛选得到的较好材料有MC-29、SX-17、SX-19、MC-67、SX-18、MC-70。

3 结论与讨论

腺毛密度和叶面分泌物含量在不同烟草基因型间存在显著差异，叶面分泌物含量与腺毛密度呈极显著正相关[43]。本研究中，突变体腺毛密度极显著高于CK的有MC-29、SX-19、MC-67、MC-70、SX-3A、SX-18、MC-8、SX-7等8份材料，而叶面分泌物总量明显高于CK的有SX-3、SX-3A、MC-67、MC-1、MC-30、SX-1等6份材料。与CK相比，MC-67和SX-3A两个材料既具有较高的腺毛密度，又具有较高的叶面分泌物含量。叶面分泌物含量不仅与密度相关，还与腺毛分泌能力相关[34]，本研究中，MC-29虽然具有较高的腺毛密度，但其叶面分泌物含量低于CK。

棕色化反应产物主要有糠醛、糠醇等，可使烟叶具有如面包香、坚果香、甜香等特殊的香味[37]。糠醛具有焦糖甜香、烘烤香气，在该批突变材料中没有找到糠醛含量增加大于25%的材料。这批材料是以腺毛密度为前提筛选出来的，因此推测，糠醛含量的增加可能与腺毛密度没有太大的关系，有待进一步筛选鉴定。

筛选叶面化学成分含量变化的突变体，在众多的性状和筛选指标中根据腺毛密度开始进行筛选是一种比较有效的方法。首先，腺毛密度易于观察，可以在小苗期进行，减少了大田种植的工作量；其次，腺毛密度和叶面分泌物、香气物质含量等密切相关。本研究发现，从叶面分泌物、中性香气成分等指标中筛选的优良株系其腺毛密度均较高。

本研究初步筛选出MC-29、SX-17、SX-19等3个香气物质含量较高的株系，可以作为高香气物质的突变材料。筛选出的具有清香气息的株系为MC-29、SX-17、SX-19，具有青草香、青香、青甜香香韵的株系为MC-67、SX-3A，类似花香气韵的株系为MC-70、SX-18、SX-17、SX-8等，具有紫罗兰香韵的株系为SX-14、MC-1等。不同香气成分含量对烟叶香韵的影响较大，后代香气成分含量表达的稳定性和相关成分的突变机制等还有待进一步研究。