罗小叶 ，王晓丹 ，邱树毅

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025； 2.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025）

我国传统白酒是世界上最古老的蒸馏酒之一，其主要以富含淀粉质的粮食为原料，经过固态、半固态及液态等方式发酵、蒸馏而成。酱香型白酒是中国蒸馏酒的重要香型之一，它采用独特的酿造工艺，高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒和长期贮存，此外，其酿造工艺还包括2次投料、9次蒸煮、8次发酵、7次取酒，长时间分轮次、分香型贮存后，精心勾调而成[1]。茅台酒是酱香型白酒的典型代表，是世界三大（蒸馏）名酒之一，以其香气幽雅、酒体醇厚丰满、回味悠长、空杯留香持久的特点深受广大消费者的青睐，是中国优质白酒的典范。

微生物的种类及数量对酱香型白酒的风味有着特殊的关系，直接参与了酱香型白酒风味物质的形成。本文介绍了本课题组对酱香型白酒从制曲、堆积到窖内发酵过程中各类微生物的研究情况，通过免培养和可培养的方法对整个酿造过程各类微生物的菌群结构及主要功能菌进行分析，从多角度认识酱香型白酒生产过程中的各类微生物，对揭示酱香型白酒发酵机理及提高白酒质量有一定的借鉴，亦对控制酱香型白酒生产工艺的稳定性和规范性具有指导意义。

1 酱香酒中的细菌研究

细菌作为酱香白酒主要微生物类群之一，在整个酿造过程中呈现出种类与功能多样性的特点，是发酵生香的动力来源，细菌菌群结构特征直接影响着代谢产物的形成，多年来针对细菌类群结构的分析一直是研究热点。

1.1 免培养方法分析酱香大曲细菌菌群结构

王晓丹等[2]研究了茅台镇酱香白酒7个企业大曲细菌菌群结构，采用高通量测序技术对样品细菌种群进行分析，得到的在各分类水平上的物种组成比例以及群落结构的情况见表1。

表1 酱香大曲细菌类群分析

研究表明，细菌类群分析平均92%以上的序列可以注释在科水平，有70%的序列可以注释到属的水平，确定酱香大曲细菌的组成以厚壁菌门（87.3%～91.8%）为主要类群，并发现了未曾报道过的蓝细菌门（0.1%～1.5%），其中芽孢杆菌属占细菌总量的60%以上，在酱香大曲细菌类群分析中属优势种类。

1.2 可培养方法分析酱香大曲细菌菌群结构及功能特性

肖蓓[3]、王婧[4]采用可培养稀释平板法分析茅台镇酱香白酒7个企业大曲细菌群落组成，从大曲样品中共分离出47株细菌，鉴定结果见表2。

表2 酱香大曲细菌种类

其中，地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌在大曲中的含量都比其他细菌多，是典型的嗜热芽孢杆菌，也是大曲中产酱香功能细菌，初步推测为地域性微生物类群。

肖蓓[3]对大曲样品中分离纯化筛选出的上述可培养细菌，进行产酶实验，结果表明，筛选出的可培养细菌可产生酸性蛋白酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶及脂肪酶，不同种类的细菌产酶种类及酶活大小差异较大。结果见表3。

其次王婧[4]对可培养细菌进行模拟固态发酵并采用GC-MS联用仪对挥发性成分进行分析，结果如表4所示，表明各株细菌的发酵产物丰富，其中四甲基吡嗪和香味物质乙偶姻含量较高。并从中筛选出产吡嗪类物质相对较高的地衣芽孢杆菌，应用到麸曲酱香型白酒生产中，并通过正交试验优化发酵条件，提高麸曲酱香型白酒酒质，增加了酱香风味。

1.3 可培养方法分析酱香酒酿造过程细菌菌群结构及功能特性

张小龙[5]以贵州遵义某酿酒有限公司提供酒醅为实验材料，通过平板划线的方法从酒醅中细菌进行分离筛选，经鉴定主要为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌等种类。

筛选到的细菌通过模拟固态发酵并利用GCMS联用仪分析产酱香浓郁的细菌的固态发酵产物，结果见表5，表明产物中芳香族及杂环类化合物含量较高，其中四甲基吡嗪含量最高，这赋予酱香型白酒以浓郁突出的酱香风味。

表3 细菌5种酶酶活测定结果 (U/mL)

表4 地衣芽孢杆菌挥发性代谢产物比例 (%)

表5 地衣芽孢杆菌挥发性代谢产物比例 (%)

1.4 酱香酒中严格厌氧的细菌菌群结构及功能特性

酒醅微生物区系是白酒酿造体系中微生物多样性研究的重点，其产生的酶类、酯类、酸类是构成酒体风味物质的前提。而厌氧培养由于技术繁琐，耗费财力而成为厌氧微生物研究的瓶颈，所以目前关于酱香白酒酿造过程中厌氧细菌的报道很少。曾超[6]采用较简单便捷的厌氧手套箱法来对酿造酒醅中厌氧细菌进行分离培养，结果在厌氧工作站中，利用平板划线法对各轮次酒醅进行分离筛选，从酒醅中分离出7株严格厌氧菌，经鉴定为解木聚糖梭菌(Clotridium xylanolyticum)、煎盘梭菌(Clostridium sartagoformum)、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、近端梭菌（Clostridium clostridiiforme）。此外通过对严格厌氧菌进行模拟固态发酵，发现木聚糖梭菌、煎盘梭菌2株严格厌氧菌具有很强的酱香气味，通过GC-MS联用仪对挥发性成分进行分析，其中含量较高的吡嗪类化合物是产生酱香味的主要物质。课题组通过对酱香型白酒酿造过程中厌氧菌的研究为今后深入探讨其功能提供一定基础。

2 酱香酒中的高温放线菌与放线菌

2.1 免培养方法分析酱香大曲高温放线菌菌群结构

高温放线菌分类地位属于细菌域（Domain Bacteria）、厚壁菌门（Phylum Firmicutes）、芽孢杆菌纲（Class Bacilli）、芽孢杆菌目（Order Bacillales）、高温放线菌科（Thermoactinomycetaceae）[7]。王晓丹[8]采用第二代高通量测序的方法对酱香大曲细菌的多样性进行了分析，同时发现高温放线菌的平均相对含量占34.40%，且不同企业大曲样品的高温放线菌含量有差异（表6）。采用免培养研究发现，高温放线菌属和芽孢杆菌属同为酱香型大曲主要优势菌群，推测高温放线菌在酱香型大曲中同样扮演了重要的角色。

表6 不同企业酱香大曲高温方放线菌与芽孢杆菌科含量对比 (%)

2.2 可培养方法分析酱香大曲高温放线菌菌群结构及功能特性

李豆南[9]、罗小叶[10]从茅台镇某酱香酒企业成品曲中采用传统的分离培养方法对样品中高温放线菌进行分离培养，结果从中分离鉴定出5株高温放线菌，分别为：嗜温高温放线菌（Thermoactinomyces thalpohillus）、甘蔗高温放线菌（Thermoactinomyces sacchari)、甘蔗莱斯氏菌（Laceyella sacchari）。模拟固态发酵和分析挥发性成分，结果显示，挥发性成分组成主要以醇类、醛类、酮类、烷烃类、酯类、萜烯类物质为主，其在感官品评方面表现出酱味和土霉异味，挥发性产物检测到的表现酱味的吡嗪类物质及表现出土霉异味的二甲萘烷醇。上述研究对了解这一种属在酱香大曲中的作用是非常必要的，也填补了高温放线菌分离筛选及其功能研究的空白。

2.3 免培养方法分析酱香大曲放线菌菌群结构

王晓丹[2]采用高通量测序的方法对茅台镇酱香白酒7个企业大曲微生物菌群结构进行探究，分析结果表明，检测到放线菌门的微生物占一定比例，主要为纤维素单胞菌科、分支杆菌科、诺卡菌科、链霉菌科、微球菌科、高温单孢菌科、丙酸杆菌科、短杆菌科、多孢放线菌科等科的放线菌，其中糖多孢菌属的平均相对含量最高，为9.2%。

2.4 可培养方法分析酱香大曲放线菌菌群结构及功能特性

对于传统白酒生产领域有关放线菌研究，主要集中在白酒发酵过程中酒醅、窖泥、发酵池、曲房和窖房空气中放线菌的分离及鉴定，罗小叶等探究酱香酒大曲中放线菌资源及功能，从中分离鉴定出了3株放线菌分别为可可链霉菌（Streptomyces cacaoi）、沙阿霉素链霉菌（Streptomyces zaomyceticus），同时对其产酶产香特性进行相关研究，见表7。结果表明，3株菌产果胶酶较为突出，固态发酵挥发性成分分析见图1。主要以酯类物质为主，且均能产生吡嗪类物质。

表7 放线菌5种酶酶活力测定结果 (U/g)

图1 酱香大曲中链霉菌挥发性成分分析

3 酱香酒中的酵母菌

酵母是白酒酿造微生物家族中不可或缺的一类微生物，从酱香型白酒制曲到酿造过程一直可以检测出，直接关系到产酒率，且能够代谢产生大量不同的风味物质，对酱香型白酒风格的形成具有重要作用。对酱香型白酒大曲和酿造过程中的酵母进行研究，揭示酿造工艺中酵母消长规律及群落结构，认识微生态环境中酵母作用及其与微生态环境中各种微生物之间的代谢关系，能进一步发挥酵母资源在白酒生产中的作用，提高酵母生物经济学价值，也为深入研究酱香型白酒发酵机理及呈香机制提供基础数据和理论依据，并对实际生产具有指导意义[11]。

3.1 免培养方法分析酱香大曲酵母菌菌群结构

王晓丹[2]采用高通量测序的方法对茅台镇酱香白酒7个企业大曲酵母菌菌群结构进行探究，分析检测到子囊菌门、酵母纲、酵母目下的酵母菌，如表8所示，其中毕赤酵母属和复膜孢酵母属的酵母种类平均相对含量最高，此外各个企业的酵母菌群结构及含量均有一定差异。

3.2 可培养方法分析酱香白酒酿造过程酵母菌菌群结构及功能特性

酱香型白酒高温制曲工艺虽然会限制酵母菌的生长和繁殖，但是仍然有部分酵母可能处于存活或者休眠状态，并且成品曲出房后及贮存过程中，在常温条件下继续网罗周围环境中的酵母，因而酱香型白酒高温大曲中仍含有一定数量的酵母[11]。课题组孔维兵[12]、陈美竹[13]、庞博[14]采用可培养方法对酱香型白酒酿造过程中的酵母菌进行分离筛选和功能特性研究，结果见表9。

表8 免培养方法分析不同企业酱香大曲酵母菌菌群结构

表9 可培养方法分析酵母菌菌群结构及特性

4 酱香酒中的丝状真菌

酱香型白酒独特的酿造工艺形成了独特的微生物群落，其中霉菌是酱香大曲中一类比较重要的微生物，种类丰富，能够分泌多种酶类和代谢产物，对酱香型白酒独特的同步糖化发酵酿造方式和风味物质的形成有重要影响。

4.1 免培养方法分析酱香大曲丝状真菌菌群结构

王晓丹[2]通过高通量测序分析茅台镇酱香白酒7个企业大曲样品霉菌种群结构，分析结果如表10所示，大曲样品中曲霉属、根霉属及横梗霉属3个属的霉菌相对含量明显高于其他属类，此外不同企业的霉菌在种类及数量上有一定差异。

4.2 可培养方法分析酱香大曲丝状真菌菌群结构及功能特性

表10 免培养方法分析不同企业酱香大曲霉菌菌群结构

表11 可培养方法分析霉菌菌群结构及特性

班世栋[15]、徐佳[16]对贵州某酱香型白酒生产企业酱香型大曲中霉菌进行研究，分别研究白曲、黄曲和黑曲不同储藏时间的大曲霉菌的数量变化、可培养霉菌的种类及产酶情况。结果表明，大曲在储藏过程中，白曲的霉菌数量最多，黄曲和黑曲的数量相差较小，总共分离到28株霉菌，见表11。通过研究酱香大曲的霉菌种类及数量，结合可培养霉菌的酶活体系，为衡量大曲品质，完善制曲工艺的操作控制生产高品质大曲提供参考依据，也为强化大曲提供研究基础。

5 展望

酱香白酒作为中国白酒重要香型，拥有独特的生产工艺和别具一格的风味，以及独特的魅力，对酱香白酒的研究也具有很高的理论价值和市场价值。

采用可培养方法和免培养技术来分析酱香白酒整个酿造过程的微生物菌群结构，从物种分类水平上详细描述了酱香白酒酿造过程各类微生物群落的特征性结构，每个企业的微生物类群组成都具有各自的特点，根据微生物类群组成分离筛选特征微生物和功能微生物，为今后酱香白酒微生物多样性及功能性的深入研究提供了新的思路。随着对酱香白酒相关研究的增多，积累了丰富的基础数据，酱香白酒的研究在不断向前发展。