张振坤，霍玲玲，刘梦夏，孙 莹，孙丽香，陈尚一，祝赛峰，吴建峰

（江苏今世缘酒业股份有限公司，江苏涟水223411）

血栓类疾病是一种常见的心脑血管病，链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂等是临床上治疗该类疾病的常用药物，但这些药物存在着纤维蛋白特异性差、体内半衰期短、需大剂量连续用药等缺点[1]。除了对现有纤溶酶进行优化改造外，寻找新型纤溶酶的研究一直在进行。微生物是纤溶酶的重要来源之一，通过对产蛋白酶的微生物进行筛选，可获得新型纤溶酶产生菌。20世纪80年代日本学者发现纳豆提取物中存在一种高效纤溶酶，命名为纳豆激酶，并证实该酶由枯草芽孢杆菌的一个近源种产生[2]。此后，国内外研究人员又从发酵食品中分离到具有产纤溶酶能力的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等芽孢杆菌[3-5]。

大曲是白酒酿造过程中微生物和酶的主要来源，芽孢杆菌是大曲中的重要菌群之一，可分泌多种蛋白酶分解蛋白类物质而产生多肽和氨基酸，为其他微生物的生长繁殖提供物质基础，同时也是白酒中多种香味成分的重要前体物质[5]。经过长期的培养筛选，大曲中富集了枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等种类丰富的高产蛋白酶的芽孢杆菌，其所产蛋白酶一般具有活力较高、温度耐受性较强等特性[6-7]。本研究从大曲中分离具有产纤溶酶能力的芽孢杆菌，为挖掘酿酒大曲微生物资源、开发新型纤溶酶提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 样品与试剂

分菌样品：中高温大曲，取自今世缘制曲中心大曲培养房。主要试剂：牛纤维蛋白原、凝血酶、尿激酶购自中国药品生物制品检定所；扩增引物27F和1492R购自上海生工生物工程有限公司。

1.1.2 主要仪器

隔水式恒温培养箱（GHP-9160），上海一恒科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅（HHS214），江苏省医疗器材厂；气浴恒温振荡器（SHZ-82），金坛市杰瑞尔电器有限公司；显微镜（BX-41），奥林巴斯；高压蒸汽灭菌锅（KG-SX-500），日本TOMY公司；凝胶成像仪，美国BIO-RAD。

1.1.3 培养基

斜面与平板培养基（g/L）：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，琼脂15，pH7.0～7.2。

初筛培养基（g/L）：葡萄糖1，酵母膏1，酪素5，K2HPO41，KH2PO40.5，MgSO40.5，琼脂15，pH7.0～7.2。

种子培养基（g/L）：葡萄糖10，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0～7.2。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨 20，KH2PO42，K2HPO44，MgSO40.5，pH 7.0～7.2。

1.2 试验方法

1.2.1 芽孢杆菌的分离与初筛

大曲粉碎，取1 g放入灭菌三角瓶中，加入100 mL无菌生理盐水，摇床振荡30 min后将三角瓶置于80℃水浴锅中保温10 min。取1 mL菌液逐级进行10倍梯度稀释，选取10-4、10-5、10-63个浓度各0.1 mL涂布平板，每个梯度做3个平行。根据菌落形态特征挑取不同的单菌落，多次划线获得纯培养菌体。

酪素平板法初筛[9]：无菌环境下从试管斜面上挑取1环菌体混入10 mL无菌水中，摇匀后分别稀释菌悬液涂布酪蛋白平板。于37℃下培养24 h。挑取有明显溶解圈的菌落接入试管斜面后以37℃培养24 h后保藏备用。

1.2.2 菌种的复筛

琼脂糖-纤维蛋白平板制作参照王刚等的方法[10]：用0.02 mol/L、pH7.4的磷酸缓冲液配制1‰（w/v）的纤维蛋白原溶液，按照每管10 mL分装入试管中，50℃保温。配制2%（w/v）浓度的琼脂糖溶液并按照每管10 mL趁热分装入试管，于50℃水浴保温，待温度平衡后每个试管加入100 μL凝血酶溶液（100 IU/mL），摇匀后将琼脂糖-凝血酶混合液倒入纤维蛋白溶液中，然后倒平板。室温凝固后打孔备用。

菌株产纤溶酶能力的定性检测：种子培养基接入初筛得到的菌种，37℃下150 r/min培养24 h。按照4%接种量接入发酵培养基，37℃下150 r/min培养48 h。发酵液5000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。取10 μL粗酶液注入纤维蛋白平板上的孔中，同时以不接菌的发酵培养基离心上清液做空白对照，以尿激酶溶液做阳性对照。于37℃温育8 h观测溶解圈。

1.2.3 菌落的形态观察与生理生化实验

将筛选到的菌株在平板上划线，37℃培养24 h后观察菌落形态并拍照；生理生化实验与结果分析参照相关文献[11-12]进行。

1.2.4 菌株基于16S rDNA的分子生物学鉴定[13]

菌株基因组DNA的提取与16S rDNA的扩增：采用煮沸法提取菌株DNA作为模板，采用通用引物27F和1492R进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后由上海生工测序。16S rDNA序列比对与系统发育树构建：将测序结果在EzTaxon和NCBI上进行比对分析，下载同源性高的菌株16S rDNA序列，并与试验菌株的序列一起用ClustalX1.8和MEGA4.0采用邻接法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 产纤溶酶芽孢杆菌的分离筛选（见图1）

用酪蛋白平板法对分离得到的纯菌株进行初筛，得到具有酪蛋白分解能力的菌株9株，编号为A2、A3、B2、B4、B6、B7、B8、C3 和 C6。采用琼脂糖-纤维蛋白平板法对上述菌株进行复筛，图1为这9株菌的粗酶液在琼脂糖-纤维蛋白平板上产生的溶解圈情况，除A2与C3外其余7株菌的粗酶液均可产生溶解圈，表明7株菌具有产纤溶酶能力。

图1 粗酶液在琼脂糖-纤维蛋白平板上产生的溶解圈

2.2 菌株的菌落形态与生理生化特性

从菌落形态来看，A2菌落圆形扁平，边缘整齐，乳白色，表面湿润；B2菌落大而不规则，菌落较厚呈蜡油状，表面湿润易挑起；B4菌落扁平，边缘锯齿状，表面干燥；B6菌落圆形，扁平，表面干燥；B7菌落圆形，有环形凸起，表面褶皱；B8菌落圆形，中部呈凸脐状，表面湿润；C6菌落大而扁平，边缘缺刻，表面干燥。

对这7株菌进行了生理生化试验，结果见表1。革兰氏染色、酪蛋白分解、淀粉水解及触酶试验等呈阳性，能在含10%NaCl培养基中生长；B7与C6不能利用柠檬酸盐，能利用丙酸盐，其余5株菌能利用柠檬酸盐而不能利用丙酸盐；除A3外均能利用D-木糖、D-甘露醇产酸。结果显示，这7株菌的生理生化特征与枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等的特征相符。

2.3 产纤溶酶芽孢杆菌的鉴定（见图2）

图2 PCR产物的凝胶电泳图

以上述7个菌株的基因组DNA为模板进行16S rDNA扩增，扩增产物进行凝胶电泳，结果见图2，均得到约1500 bp的单一条带，条带清晰。

将16S rDNA的测序结果在EzTaxon和NCBI上进行比对分析，这7株菌的比对分析结果见表2。

表1 生理生化实验结果

由7株试验菌株与相关模式菌株所构建的系统发育树（见图3）可以看出，这7株菌可分为3支。A3与模式菌株Bacillus cereus聚为一支，B2与Bacillus aerius聚为一支，均具有高度同源性；其余5株菌与枯草芽孢杆菌及其近源种群聚为一支。综合菌落形态、生理生化特征及16S rDNA比对结果和发育树分析，A3被鉴定为Bacillus cereus，B2被鉴定为Bacillus aerius，B4被鉴定为Bacillus methylotrophicus，B7被鉴定为Bacillus siamensis；B4被鉴定为Bacillus methylotrophicus；B6被鉴定为Bacillus subtilis；B8被鉴定为Bacillus tequilensis；C6被鉴定为Bacillus amyloliquefaciens。

表2 7株菌的16S rDNA序列比对结果

图3 7株菌基于16Sr DNA构建的系统发育树

3 讨论

纤溶酶是一种蛋白酶，近年来的研究多以高蛋白发酵食品为材料筛选纤溶酶产生菌，较少涉及其他材料[1，5]。本研究以酿酒大曲这一传统固态发酵酶制剂为材料，分离到7株具有产纤溶酶能力的菌株，丰富了纤溶酶产生菌的筛选来源。经鉴定这7株菌中有1株为蜡状芽孢杆菌，1株为空气芽孢杆菌，其余5株为枯草芽孢杆菌的亚种及其近缘种群。在序列比对及构建发育树过程中注意到枯草芽孢杆菌亚种及其近缘种的16S rDNA序列相似性很高，对这些近缘种需另外借助gyrB或gyrA、rpoB等基因序列进行更准确的区分[12]。同时，将对这7株纤溶酶产生菌的酶活力进行定量测定，从中筛选出高产纤溶酶菌株，并对其最佳产酶条件及酶学性质等做进一步研究。