陈文玲 王宪东 陈文慧 朱晓松 姚 政 石安华

(1 云南中医学院,昆明,650000; 2 云南省中医中药研究院,昆明,650223)

肝纤维化(Hepatic Fibrosis)是指肝脏内弥漫性细胞外基质过度增生堆积的病理阶段,是肝脏在多种病因的作用下,肝细胞损伤后自我修复的病理反应。诱发肝纤维化的病因多种多样,其中病毒性肝炎为主要病因[1]。肝纤维化早期症状不明显,患者常无明显表象,如不及时治疗,发展到后期极容易发展成为肝硬化[2]。慢性肝病现已成为威胁全球的人类身体健康的主要诱因,且在肝硬化失代偿期难以治疗,病死率极高,所以早期治疗及预防肝纤维化的发生极为关键。α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth Muscle Actin,α-SMA)是肝星状细胞(HSC)活化的标志,活化的HCS胞体展开,突出延长,增殖活跃,胞质内脂滴消失,表达α-SMA,产生ECM的能力增强,表明已转变为肌成纤维细胞(Myofibroblast,MFB),除了增加基质成分的合成之外,还能调节ECM的降解,在肝纤维化的进程中起核胞。我们在前期研究中发现,健脾软肝方可以有效的治疗二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化大鼠,健脾软肝方抑制ColⅠ、ColⅢ胶原的合成,促使其降解,并在抑制HSC活化等方心作用。肝脏中仅有大血管壁平滑肌细胞存在α-SMA表达,其余肝脏细胞内都无α-SMA表达;若肝脏细胞中出现大量α-SMA细胞表达,说明肝星状细胞已经转化为肌成纤维细面较优[3],但是否与α-SMA蛋白及其mRNA的表达有关还不清除,本实验以肝纤维化为研究对象,通过检测肝纤维化大鼠α-SMA蛋白及其mRNA表达的影响,探讨健脾软肝方抗肝纤维化的机制是否与肝纤维化形成和发展有关。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 本实验选用健康雄性大鼠60只,体重(150±10) g,由四川达硕生物科技有限公司提供,动物质量合格证书编号:0017752。所有大鼠自由饮水、摄食，云南中医学院实验动物房中分笼饲养，环境温度20～22 ℃，相对湿度50%～55%，通风良好。

1.1.2 药物 健脾软肝方由兰花参、白芍、莪术、香附、三七等中药组成,生药购自云南中医学院校医院门诊部药方,扶正化瘀胶囊购自于云南省中医医院门诊部药方,生产厂家为上海黄海制药有限责任公司,生产批号:140309。

1.1.3 试剂与仪器 1)主要试剂：鼠抗α-SMA单克隆抗体，由博士德生物有限公司提供，大鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)ELISA检测试剂盒及DAB免疫组化显色试剂盒由生工生物工程(上海)有限公司提供。2)主要仪器：DGX-9140电热恒温干燥箱(太仓市华利达实验设备有限公司)，荧光显微镜、Image-pro Plus5.0图像分析系统(日本Olympus株式会社)，SW-CJ-1D洁净工作台(江苏苏洁净化设备厂)，HC-2518R高速冷冻离心机(安徽中科中佳仪器有限公司)，TU-1901紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，PCR反应扩增仪、移液器(加拿大BIO公司)，StepOne型荧光定量PCR仪(美国应用生物系统中国公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物的分组与模型制备 实验所用动物随机分为6组,即正常组,模型组,扶正化瘀胶囊组,健脾软肝方低剂量组,健脾软肝方中剂量组,健脾软肝方高剂量组,10只/组。肝纤维化动物模型的建立成功与否,是研究肝纤维化发生发展的前提。本实验从第1周起,2次/周对大鼠进行腹腔注射,共注射四周,剂量为0.2 mL/100 g。其中模型组、扶正化瘀胶囊组、健脾软肝方低剂量组、健脾软肝方中剂量组、健脾软肝方高剂量组分别腹腔注射70%橄榄油与30% CCl4混合溶液,正常组腹腔注射等量的生理盐水。各组大鼠均给予普通饲料饲养,自由饮水。

1.2.2 动物给药剂量及方法 健脾软肝方按等效剂量换算法,成人每日用量为60 g,每200 g大鼠1 d所需生药量(g)=60 g×0.018=1.08,为0.54 g/100 g·d。扶正化瘀胶囊组规格为0.3 g/粒,成人每日每次用量为:3次/d,5粒/次。据人和大鼠间体表面及折算的等效剂量比值表计算临床等效剂量,从第一周开始给予空白组和模型组等量的生理盐水灌胃,健脾软肝方高、中、低剂量组每天给予相应剂量灌胃(分别是1.08 g/100 g·d、0.54 g/100 g·d、0.27 g/100 g·d),扶正化瘀胶囊组给予灌胃0.0405 g/100 g·d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 病理组织学检查 病理组织学采用H-E及Mallory染色2种染色方法,染色后通过光学显微镜观察并记录切片中大鼠肝组织的病变程度。在第4周末,各组大鼠禁食12 h,饮水正常。第2天以10%的水合氯醛配90%生理盐水,按照每0.25 mL/100 g的剂量计算,对大鼠腹腔注射麻醉,迅速取出大鼠肝脏,分切成1 cm×1 cm×3 cm,置于福尔马林溶液保存备用,并分别进行脱水、包埋、脱蜡、染色、封片,进行H-E及Mallory染色观察。

1.2.3.2 肝纤维化分级 肝纤维化的分级标准是根据观察汇管区周围肝细胞炎性反应程度、小叶内情况及纤维增生程度,将肝纤维化分为4级,具体分级标准参考中华医学会2002年肝病学肝纤维化诊断及疗效评估共识[4]。见表1。

表1 肝纤维化分级

1.2.3.3 免疫组化ABC法检测大鼠肝组织中α-SMA的蛋白表达 将标本放置于4%多聚甲醛常规灌注固定,取材后放置于20%蔗糖溶液12 h,制作蜡块,制作切片,并贴片,PBS清洗。之后将切片分别放置于0.3%的过氧化氢甲醇溶液30 min、0.3% Triton X100 30 min、血清稀释液稀释的一抗在4 ℃冰箱中放置24～48 h、于PBS稀释的的二抗中室温孵育2 h、ABC复合物之类的抗体室温孵育2 h,最后将切片放置于显色液中,进行染色,时间控制在30 min左右,在这期间需要经常在显微镜下进行观察,若细胞着色且背底颜色较淡时,应迅速清除显色液,α-SMA蛋白阳性表达在切片上呈棕黄色,利用Image-pro Plus 6.0软件分对切片进行定量分析,每张切片在光学显微镜下去5个视野(×40),测定α-SMA蛋白阳性表达的灰度值与总视野面积比值。

1.2.3.4 采用Real-time PCR法检测cDNA样本中α-SMA基因相对含量 大鼠肝组织α-SMA的表达采用Real-time PCR法。将大鼠肝脏组织均质化、匀浆并离心,提取上清液,之后相分离上清液,抽取肝组织水相中的总RNA,按试剂盒说明操作,然后以cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列:α-SMA上游引物5′-CGGGAGAAAATGACCCAGAT-3′，下游引物5′-CCAGAGTCCAGCACAATACCA-3′；内参β-actin上游引物5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物5′-AGCCACCAATCCACACAGAG-3′；在PCR管中加入total RNA,Random Primer p(dN)6,之后冰浴,离心加入下列试剂,37 ℃温浴5 min、42 ℃温浴60 min、70 ℃温浴10 min。终止反应,最后将上述溶液-20 ℃保存。完成上述步骤后，把加好样品的96孔板放在ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪中进行反应。收集数据,采用2-△△Ct法,通过Ct值对样本基因表达量的进行计算。

2 结果

2.1 大鼠大体形态和大鼠肝脏观察 实验从第一周便开始造模,正常组大鼠饮食饮水正常,毛色光泽,大小便正常,身体状态良好。模型组大鼠进食及进水量均减少,毛色暗黄无光泽,大便时而稀溏不成形,小便色黄,精神萎靡,注射部位无红肿感染,肛门区红肿。健脾软肝方高、中、低剂量组大鼠与模型组比较活动度较好,进食进水量较模型组比较有所增加,毛色较光泽,大便时而有稀溏但总体状况较好,腹腔注射部位无感染。正常组大鼠肝脏呈褐色,体积适中,表面光滑,质地柔软,边缘呈锐圆状,无结缔组织粘连,无包块。模型组大鼠肝脏较正常组颜色浅,呈暗红色,肝脏体积大于正常组,表面有结节,质地较硬,边缘呈钝圆庄且有结缔组织粘连。扶正化瘀胶囊组及健脾软肝方高、中、低剂量组大鼠肝脏颜色较模型组色泽变深,表面较光滑,肝脏大小与正常组比较稍微增大,表面有轻微结节,质地硬,但总体状况好于模型组。

图1 正常组

图2 模型组

图3 扶正化瘀胶囊组

图4 健脾软肝方高剂量组

图5 健脾软肝方中剂量组

图6 健脾软肝方低剂量组

2.2 大鼠肝脏病理组织学观察 H-E染色,光学显微镜下提示,正常组大鼠肝小叶结构正常,肝细胞呈现卵圆状,并以中央静脉为圆心,肝细胞呈放射状排列,细胞核呈圆形,肝索排列规则。模型组大鼠肝细胞肿胀变形,假小叶形成,肝索排列紊乱,局部肝细胞发生脂肪变性,胶原纤维组织扩大。此种现象说明CCl4诱导的肝纤维化大鼠造模已经成功。健脾软肝方高、中、低剂量组及扶正化瘀胶囊组病变程度与模型组比较,病变程度较轻,肝索排列紊乱,有假小叶形成,脂肪病变程度较轻,有少许脂肪样空泡形成,且胶原纤维减少,但光镜下并不能明显判断各组间差别。

图7 正常组×100

图8 模型组×100

图9 扶正化瘀胶囊组×100

图10 健脾软肝方高剂量组×100

Mallory染色时,切片上胶原纤维会表现为蓝色丝带状组织。光学显微镜下,正常组大鼠肝小叶结构正常,肝细胞呈卵圆状,肝细胞呈放射状排列,细胞核圆形,肝索排列规则。模型组大鼠肝细胞变性,假小叶形成,大量脂肪空泡出现,纤维结缔组织大量沉积,肝小叶和汇管区机构被破坏。健脾软肝方高、中、低剂量组及扶正化瘀胶囊组有假小叶形成,各组汇管区有少量纤维结缔组织沉积,并少量脂肪空泡聚集,肝小叶的结构有一定程度的破坏,但总体破坏程度较与模型组比较好。

图11 健脾软肝方中剂量组×100

图12 健脾软肝方低剂量组×100

图13 正常组×40

图14 模型组×40

2.3 肝纤维化的分级程度 Mallory染色完成后,观察切片后发现,模型组大鼠肝组织中,假小叶形成较多,大部分处于S3型这一阶段这也从侧面提示动物模型复制成功。健脾软肝方高、中、低剂量组及扶正化瘀胶囊组大鼠肝组织中有少量胶原纤维形成,但大部分处于S2阶段,说明治疗后有一定效果,各组大鼠肝纤维化程度有所减轻。

图15 扶正化瘀胶囊组×40

图16 健脾软肝方高剂量组×40

图17 健脾软肝方中剂量组×40

图18 健脾软肝方低剂量组×40

表2 肝纤维化的分级程度(只,n=10)

注:与模型组比较*P<0.05;与正常组比较,△P<0.05

2.4 各组大鼠肝组织α-SMA蛋白的表达的观察 肝组织α-SMA蛋白的表达,正常组大鼠肝组织中仅在血管壁周围见少量α-SMA表达,模型组大鼠肝组织中见大量α-SMA表达,主要集中在汇管区、中央静脉、假小叶纤维膈及临近的肝窦区周围。正常组与模型组比较,模型组显著上升(P<0.05);扶正化瘀胶囊组与模型组比较有显著性差异(P<0.05);健脾软肝方高、中、低剂量组组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),健脾软肝方高、中、低剂量组之间α-SMA蛋白在肝组织中阳性表达逐渐升高,可以呈一定的药物依赖关系。

注:与模型组比较*P<0.05;与正常组比较,△P<0.05

图19 正常组(×400)

图20 模型组(×400)

图21 扶正化瘀胶囊组(×400)

图22 健脾软肝方高剂量组(×400)

图23 健脾软肝方中剂量组(×400)

图24 健脾软肝方低剂量组(×400)

2.5 各组大鼠肝组织α-SMA mRNA的表达 肝组织α-SMA mRNA的表达:正常组与模型组比较,模型组显著上升(P<0.05);扶正化瘀胶囊组为与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05);健脾软肝方高、中、低剂量组组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),高、中、低剂量组之间α-SMA mRNA表达水平逐渐升高,呈一定的药物依赖关系。

表4 各组大鼠肝组织α-SMA mRNA的表达

注：与模型组比较*P<0.05;与正常组比较,△P<0.05

3 讨论

肝纤维化是一种慢性肝损伤导致的肝脏病理改变,HSC的活化是肝纤维化发生的中心环节[5]。HSC在肝脏中称之为储脂细胞,属于肝脏间质细胞,正常情况下HSC呈卵圆状,位于肝索与肝窦壁之间,可以贮藏脂肪与维生素A,合成少量金属蛋白酶抑制剂等,当各种致病因素持续作用于肝脏时,通过复杂的机制激活HSC。HSC被激活后,转化为肌成纤维细胞,然后其在肝脏内合成胶原纤维、蛋白多糖及糖蛋白等,从而形成了ECM并大量堆积于肝脏中,最终导致肝纤维化的发生[6]。平滑肌肌动蛋白共分为γ亚型、α、β 3型,其中α-SMA所占比例最高,α-SMA存在于脊椎类动物细胞中,其在细胞内有丰富的能聚合成微丝,微丝可以撑起细胞的骨架,加强细胞的能动性,并可以促进细胞的收缩及形成[7]。在生理条件下,α-SMA主要由平滑肌细胞和肌成纤维细胞表达,其表达很少,仅存在于血管壁上。当HSC被激活后,α-SMA表达大量增加,并附着于假小叶增生的纤维膈内。在各种急慢性肝病及相应的动物模型中,大鼠HSC在活化过程中丧失Desmin,转而表达α-SMA[8]。α-SMA是HSC活化的特有标志物,α-SMA的表达与HSC的活化、增殖、复制呈正相关[9]。刘成[10]教授观察肝纤维化形成过程中α-SMA与门脉压力变化之间的关系,研究发现随着肝纤维化程度的加重,α-SMA的表达也逐渐增加,二者呈正相关,且随着α-SMA病变面积的扩大,门脉压力也随之增加,二者也呈正相关。

α-SMA作为肝细胞内肌动蛋白之一,对肝纤维化的发生发展起重要作用,是肝星状细胞活化的重要标志。谢君等[11]观察肝苏颗粒对CCl4致肝纤维化大鼠肝功能和病理损伤的影响,免疫组化结果发现肝苏颗粒可以降低α-SMA蛋白的表达,改善肝功能,减轻肝纤维化的病变程度。邵佳亮等[12]观察羟基喜树碱对CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型具有防治作用,结果发现羟基喜树碱可以抑制肝星状细胞的增殖,减少α-SMA蛋白的表达。本次实验,我们采用免疫组化ABC法检测大鼠肝组织中α-SMA蛋白的表达,通过结果,我们观察发现,正常组大鼠肝组织中仅在血管壁周围见少量α-SMA蛋白表达,模型组大鼠肝组织中见大量α-SMA蛋白表达,主要集中在汇管区、中央静脉及临近的肝窦区周围。扶正化瘀胶囊组,健脾软肝方高、中、低剂量组在汇管区也可见α-SMA蛋白的表达,但其病变程度比较模型组有所减轻,说明健脾软肝方可以减少α-SMA蛋白的表达。马力等[13]观察疟母丸对进展期大鼠肝纤维化的干预作用,研究发现疟母丸可以显著的降低α-SMA mRNA的表达,抑制肝纤维化的进展,且这一机制与抑制HSC的活化有关。吴芙蓉等[14]观察橙皮苷对化学性肝纤维化大鼠α-SMA表达的影响,实验结果发现橙皮苷可以显著的降低大鼠肝组织中α-SMA及其mRNA的表达,提示橙皮苷对化学性肝纤维化大鼠具有很好的保护作用,其机制与抑制肝星状细胞的增殖、活化有关。本次实验,我们采用Real-time PCR法检测大鼠肝组织中α-SMA mRNA的表达,通过结果,我们观察发现,正常组大鼠肝组织中仅少量表达α-SMA mRNA,正常组与模型组比较,模型组大鼠肝组织中α-SMA mRNA表达显著上升(P<0.05);扶正化瘀胶囊组与模型组比较,肝组织中α-SMA mRNA表达显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);健脾软肝方高、中、低剂量组肝组织中α-SMA mRNA表达也显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),高、中、低剂量组之间α-SMA mRNA表达水平逐渐升高,呈一定的药物依赖关系。由此可见,我们的结果与众多专家的研究结论相一致,说明健脾软肝方可以减少α-SMA mRNA的表达,其机制可能与抑制HSC的活化有关,从而起到治疗肝纤维化的作用。此外,大鼠肝脏病理组织学Mallory染色结果也显示,健脾软肝方高、中、低剂量组及扶正化瘀胶囊组大鼠肝组织汇管区有少量纤维结缔组织沉积,并少量脂肪空泡聚集,肝小叶的结构有一定程度的破坏,但总体破坏程度较模型组比较好,这进一步说明了健脾软肝方可以改善大鼠肝纤维化的病变程度。