桑雅丽，李晓春，王欣宇，王俊丽，刘 鑫，尚大勇

（赤峰学院，内蒙古 赤峰 024000）

1 前言

原花青素，是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮.其结构是由不同数量的儿茶素、表儿茶素或没食子酸经C4-C6或C4-C8键缩合而成[1].原花青素是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂.葡萄中富含原花青素，尤其是在葡萄籽中达到ω(原花青素)≥5﹪的含量[2].作为世界上种植面积最大的水果，葡萄主要用于酿造葡萄酒，随之产生的下脚料葡萄籽并未得到充分利用，因此葡萄籽中提取原花青素具有一定的经济价值和积极意义.

目前对葡萄籽中提取原花青素的研究方法有很多，主要有超声波辅助提取法、溶剂萃取法、微波辅助提取法、超临界CO2提取法、离子液体辅助提取法、酶提取法等[3-9].比较常用的方法是超声波辅助提取法和溶剂萃取法[10].超声波辅助提取法具有提取效率高、提取时间短、提取温度低、能保护有效成分及操作简单易行等优点.而采用溶剂萃取法得到的原花青素纯度较高，实验成本较低，方法易于操作.

由于葡萄籽中原花青素的提取及其含量测定是一个综合性的实验，其中涉及了称量、干燥、研磨、过滤、抽滤等系列基本操作，同时在实验中受诸多因素影响，导致提取纯度和测定含量会有所不同.本实验采用超声波辅助提取法和溶剂萃取法来提取葡萄籽中的原花青素，并对其含量进行了测定.通过对比找到适宜的实验条件，并提供一定的借鉴作用.

2 实验部分

2.1 仪器及试剂

仪器：恒温水浴锅（HH-Z，上海市宇隆仪器有限公司）、722N可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）、电子天平（TP-214，北京赛多利斯仪器系统有限公司）、旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）、超声波清洗机（SB-5200 DTN，宁波新芝生物科技股份有限公司）、100目筛（上虞市沪江仪器厂）.

试剂：石油醚（60-90）（GB-AR 沸程60-90℃，西陇化工股份有限公司，批号20120115）.

丙酮（GB-AR 含量不少于99.5%，天津市富裕精细化工有限公司，批号20100905）.

无水乙醇（GB-AR 含量不少于99.7%，西陇化工股份有限公司，批号20120201）.

香草醛（HG-AR 含量不少于99.0%，天津市大茂化学试剂厂，批号20100504）.

甲醇（GB-AR 含量不少于99.5%，西陇化工股份有限公司，批号 20120101）.

原花青素标准品（GB-AR 含量不少于95%，上海市源叶生物科技有限公司，批号20100121）.

葡萄籽（取自内蒙古赤峰的山葡萄，用于酿酒后得到的废弃葡萄籽）.

2.2 实验原理

2.2.1 提取原理

超声波辅助提取法（以下简称超声波法）是利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速有效物质的释放、扩散和溶解，显著提高提取效率的提取方法.超声波在提取葡萄籽中原花青素方面的应用主要是和溶剂配合，使提取效率提高.溶剂萃取法一般是指从天然产物中提取有效部位的方法，根据天然产物中各种成分在溶剂中的溶解性，选用对活性成分溶解度大、对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从天然产物组织内溶解出来的方法.

由于葡萄籽中原花青素与蛋白质、多糖形成稳定的复合物，因此在提取时对溶剂有一定的要求.不仅要求溶剂对原花青素有良好的溶解性，还要对氢键有破坏作用.通常选用有机溶剂或含水的有机溶剂.而使用乙醇、丙酮等有机溶剂提取葡萄籽中的原花青素的同时，也能萃取脂肪油类，这就需要在提取之前必须先除去葡萄籽中的油脂.由于原花青素不溶于石油醚，因此沉淀过程常选用石油醚使原花青素沉淀下来.

2.2.2 含量测定原理

盐酸-香草醛法测定原花青素的含量，其原理是基于原花青素A苯环（如图1）化学活性较高，其上的间苯二酚或间苯三酚可与香草醛发生酚醛缩合反应，在浓酸的作用下，C-4位具有极强的亲电性，其醇羟基与C-5、C-7上的酚羟基组成一个苄醇系统，使得4位碳易于生成红色的正碳离子，此红色的正碳离子由于含有p键的不饱和基团，所以可以吸收可见光，据此正碳离子的吸光度可测定原花青素的含量[11].

采用分光光度法在400-760nm范围内对原花青素标准品进行紫外扫描测定其吸光度，并且以原花青素标准品配成标准系列溶液，测定吸光度并绘制标准曲线，根据标准曲线即可得到样品中原花青素含量[12].使用盐酸为催化剂，可以避免出现原花青素氧化分解的情况.

图1 酚醛缩合反应机理

2.3 实验步骤

2.3.1 超声波法提取原花青素

将山葡萄籽倒入研钵中研磨，过100目筛，准确称取5.0239g脱脂的山葡萄籽粉末于100mL小烧杯中，加入50mL石油醚，常温浸泡48h，并用玻璃棒间歇搅拌.用布氏漏斗减压抽滤，脱去溶剂和油脂.滤饼置于250mL三颈烧瓶中，加入100mL丙酮、无水乙醇或者纯水，在25℃室温下提取操作2h，全过程施加超声波震荡处理.用布氏漏斗减压抽滤，并用少量溶剂洗涤滤饼3次，合并滤液和洗涤液置于250mL三颈烧瓶中，用旋转蒸发仪浓缩成浆状物后转移至蒸发皿中，在60℃下烘干产品，粉碎后即为山葡萄籽提取物原花青素.称量，计算提取率.

2.3.2 溶剂萃取法提取原花青素

将山葡萄籽倒入研钵中研磨，过100目筛，以石油醚（60-90）为溶剂，用索氏提取器抽提8h，待石油醚挥发后晾干备用.准确称取5.0239g脱脂的山葡萄籽粉末，用无水乙醇为溶剂，料液比为1:7，于48.6℃水浴旋转摇床上浸提3次，每次10min，过滤，并用浸提液洗涤残渣，合并提取液.以酚酞为指示剂，用40%NaOH溶液滴定至溶液呈中性，过滤.采用旋转蒸发仪于40℃、真空度为0.085MP条件下进行真空浓缩，将浓缩后的产品置于100mL小烧杯中，加入4倍体积的石油醚混合均匀后，将溶液静置2h，过滤沉淀，置于烘干箱中烘干，得到低聚原花青素粗品.称量，计算提取率.

2.3.3 原花青素的含量测定

配制试剂 A：1%香草醛溶液（称取1.0000g香草醛溶于甲醇溶液中，定容至100mL）；B：8%的盐酸液（取8.00mL浓盐酸溶于甲醇中，定容至100mL）；显色剂：A:B=1:1，现用现配.

最大吸收波长的确定 配制原花青素标准溶液，浓度为0.6mg/mL.取1.00mL于比色管中，加入5.00mL显色剂，摇匀，避光.在30℃恒温水浴中保持30min，取出比色管.以甲醇液为空白液，用722N可见分光光度计在350nm-700 nm之间确定最大波长.

标准曲线的绘制 分别取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL原花青素标准液于10mL容量瓶中，然后用甲醇定容至10mL.各取1.00mL（另取1.00mL甲醇液为空白液）于比色管中，分别加入5.00mL显色剂，摇匀，避光.在30℃恒温水浴中保持30min，保温比色.取出比色管，在500nm波长下，测定其吸光度，得到浓度及吸光度数据（见表4），并根据数据绘制标准曲线(见图3).

原花青素的含量测定 分别准确称取以超声波法提取溶剂为丙酮、无水乙醇和纯水的提取物及以溶剂萃取法提取出的提取物各0.5001g置于50mL小烧杯中，用适量甲醇溶液溶解转移至50mL容量瓶，用甲醇定容至刻度.分别取1.00mL于比色管中，加入显色剂，显色分析.

3 实验数据及结果

3.1 数据处理计算关系

超声波提取法：

表1 超声波法使用不同溶剂得到原花青素的提取数据

实验结果表明：提取山葡萄籽中原花青素时不同溶剂对原花青素的提取率有一定的影响，由表1数据可知，分别以乙醇、丙酮和纯水为溶剂提取时，纯水的提取率最低，而乙醇的提取率最高.

溶剂萃取法：

表2 溶剂萃取法使用乙醇为溶剂得到原花青素的提取数据

表1和表2的实验结果表明，室温下以乙醇为溶剂的超声波法提取原花青素提取率较高，而溶剂萃取法提取原花青素率则不及超声波法效果好.

3.2 原花青素纯度分析

原花青素标准品紫外扫描图

表3 原花青素标准品紫外扫描数据

图2 原花青素标准品紫外扫描曲线

由表3数据作图（见图2），得到原花青素标准品紫外扫描曲线：原花青素的最大吸收波长为500nm，因此确定盐酸-香草醛法测定原花青素的波长为500nm.

原花青素标准曲线

表4 原花青素标准曲线数据

图3 原花青素标准曲线

3.3 试样中原花青素百分含量测定

超声波法：

实验测得以乙醇为溶剂的试样原花青素的吸光度为0.137，根据原花青素标准曲线可得：试样中原花青素浓度为0.125mg/mL，则试样中所含原花青素的含量为12.50%；当提取溶剂为丙酮时，测得试样原花青素的吸光度为0.109，根据原花青素标准曲线可得试样中原花青素浓度为0.082mg/mL，则试样中所含原花青素的含量为8.20%；当提取溶剂为纯水时，测得试样原花青素的吸光度为0.099，根据原花青素标准曲线可得试样中原花青素浓度为0.075 mg/mL，则试样中所含原花青素的含量是7.50%.

溶剂萃取法：

实验测得以乙醇为溶剂的试样原花青素的吸光度为0.125，根据原花青素标准曲线可得试样中原花青素浓度为0.120mg/mL，则试样中所含原花青素的含量为12.00%.

3.4 分析与讨论

用山葡萄籽提取原花青素的实验过程中，山葡萄籽的粉碎预处理对原花青素的提取率有一定的影响.须将山葡萄籽研磨的很细，然后将山葡萄籽分别过60和100目筛进行提取，过60目的山葡萄籽粉的提取物太少，无法进行后续实验，因此100目是最适宜的处理方式.在用超声波法提取原花青素的实验过程中，以石油醚为溶剂脱脂时，须保持烧杯内的石油醚与外界空气隔绝.因为石油醚易挥发，而山葡萄籽粉须用石油醚浸泡48h脱脂，所以要将烧杯口覆上保鲜膜以防石油醚挥发.使用旋转蒸发仪蒸发溶剂时，一定要将溶液蒸发浓缩至浆状物.使用溶剂萃取法提取原花青素时，第一步用索氏提取器脱去油脂，要注意回流时间和温度的控制.因为高温条件下，较长的反应时间可能会引起原花青素类物质的氧化，所以保持回流时间在8h即可，温度控制在85℃.实验过程中，需要中和乙醇，应该以酚酞作指示剂，用NaOH溶液滴定至中性.

4 实验结论

本实验采用超声波辅助提取法和溶剂萃取法分别提取山葡萄籽中的原花青素，结果表明：以乙醇为溶剂，温度在25℃时，使用超声波辅助提取法时，5.0239g山葡萄籽可提取0.1785g原花青素，其提取率为3.55%，提取的原花青素纯度为12.50%.比相同质量的山葡萄籽以溶剂萃取法提取得到的原花青素提取率和纯度更高.同时，由于超声波法所用时间较短，所用的溶剂乙醇价格低廉，易于购买.综合考虑得出以乙醇为提取溶剂的超声波辅助提取法更具优势.