武学庆，居云悦 ，焦东亮 ，赵敏,*

1．引言

甲基苯丙胺，俗称冰毒，属于苯丙胺类兴奋剂（Amphetamine-type stimulants, ATS），是一类成瘾性的神经兴奋物质[1-2]。这类精神活性物质具有成瘾性及严重的神经毒性[3-4]，对国家、社会、家庭及个人造成严重的不良影响和经济负担，是当今医学界面临的新挑战。因此，研发行之有效的治疗方法至关重要。

rTMS是基于电磁感应原理在大脑中形成电场的一种神经刺激和神经调节技术，其形成的磁场能够无衰减地穿透颅骨进入大脑皮层，使大脑皮层的局部电活动发生变化，从而发挥治疗效果[5]。大量研究表明，rTMS能够治疗多种严重的神经精神疾病，如精神分裂、抑郁、中风、帕金森、癫痫等，其原因可能与rTMS能够调节大脑皮层的兴奋性，改变突触结构及神经元可塑性，调节脑内神经递质的释放以及促进神经再生等有关[6-8]。

近年来，研究人员开始应用rTMS对药物成瘾的治疗作用进行相关探索。临床研究发现：rTMS可以有效减轻成瘾者对海洛因、尼古丁、可卡因和酒精等的渴求程度。如Shen等人用高频（10Hz）rTMS刺激海洛因成瘾者左侧DLPFC，发现成瘾者对海洛因的渴求降低[9]；Prip fl等人同样应用10Hz的rTMS对尼古丁成瘾者左侧DLPFC进行刺激，结果发现rTMS能降低患者对尼古丁的渴求[10]；Terraneo等的研究应用rTMS（15Hz）刺激可卡因成瘾者左侧DLPFC，能降低患者对可卡因的渴求[11]；Mishra等应用rTMS（10Hz）刺激酒精成瘾者刺激右侧DLPFC，发现rTMS也能减轻酒精成瘾者的渴求[12]。同时动物研究还发现：用rTMS（20Hz）刺激吗啡戒断大鼠额叶时，伏隔核脑区的多巴胺释放水平显著增加[13]。而Li等人应用低频（1Hz）rTMS刺激甲基苯丙胺成瘾者DLPFC区，发现低频刺激能够增加成瘾者对甲基苯丙胺的心理渴求[14]。这些研究提示高频rTMS对药物成瘾可能具有潜在的治疗作用。

目前国内外关于rTMS治疗甲基苯丙胺成瘾的研究很少，rTMS对甲基苯丙胺成瘾的作用尚且不明。因此本研究应用甲基苯丙胺诱导的大鼠条件性位置偏爱模型，结合rTMS技术，探索高频rTMS对甲基苯丙胺成瘾的作用，为日后临床上应用rTMS治疗甲基苯丙胺成瘾提供初步的理论依据。

2．实验材料和方法

2.1 实验动物

我们使用雄性SD（Sprague Dawley）大鼠进行实验。大鼠重250 (100)g，n=70，其中，17只用于建立CPP复吸模型（Con: n=6; METH 1: n=6; METH 2: n=5），27只用于实验一(SAL: n=7; METH + sham:n=10; METH + rTMS: n=10)，26只用于实验二（SAL:n=7; METH + sham: n=9; METH + rTMS: n=10）。由中国科学院上海药物研究所动物实验中心提供，饲养环境为恒温（23 ± 2 ℃），湿度50%，自由进食、进水，12 h光暗循环。所有实验操作均严格遵循实验动物管理委员会批准的《实验动物研究方案》。

2.2 药品试剂

甲基苯丙胺：中国军事科学院提供。

2.3 建立条件性位置偏爱复吸模型

CPP实验器材购自上海吉量。条件位置偏爱箱为两个大小相同的条纹箱，尺寸：40 cm*40 cm*60 cm，中间隔着一块可移动的板子，能使大鼠在两箱之间自由穿梭。两侧条纹箱肉眼可辨：其中一侧箱子的图案由水平黑白相间的条纹组成；而另一侧箱子是垂直黑白相间的条纹。

实验主要分为三大阶段：大鼠条件性位置偏爱行为的形成、消退和复吸。

我们首先建立大鼠条件性位置偏爱实验。条件性位置偏爱实验主要分为四个阶段：适应期（Habituation）， 条 件 化 前 期 (Preconditioning Test)， 条 件 化 期 (Conditioning)和 测 试 期 (Postconditioning/Post-training Test)。在适应期，封闭中间隔板，使大鼠分别适应两个条纹箱的环境，左右两边各30 min，适应间隔6 h；条件化前期，即预跑期，中间隔板打开，使大鼠自由穿梭在两条纹箱之间，时间为15 min，分别记录大鼠在两箱中的停留时间；条件化期为期四天，将大鼠分成生理盐水对照组（Con）和CPP模型组（METH 1与METH 2），根据预跑阶段记录的时间结果，将两侧箱子分为偏爱箱与非偏爱箱，其中大鼠停留时间较长的那一侧为偏爱箱，另一侧为非偏爱箱,并将非偏爱侧箱子作为药物配对箱。在CPP模型组，每日上午给予每只动物腹腔注射生理盐水（1 mg/kg），注射后立即放入偏爱箱中，用隔板封闭通道，观察45分钟后取出放回笼中；隔6 h后腹腔注射一次METH（1 mg/kg），注射药物后立即放入药物配对箱内，用隔板封闭通道，观察45分钟后取出。连续训练4天，共注射4次METH和4次生理盐水。生理盐水组仅注射生理盐水。第四阶段为测试期，将实验鼠放入箱子内，打开中间隔板，使大鼠在两个箱子间自由活动15分钟，记录大鼠在每个箱子的停留时间。CPP分数是测试期在非偏爱侧的停留时间减去预跑期在非偏爱侧的停留时间。

成功建立起大鼠的CPP行为后，对大鼠进行消退训练（Extinction）。消退方式类似条件化期，将原本注射METH的那一侧，改为注射生理盐水（1 mg/kg）并放入非偏爱箱进行消退训练，连续训练4天后进行消退测试（Extinction Test）。

最后，大鼠的偏爱行为消退后，采用药物诱发的方式进行复吸测试(Reinstatement Test)，即在测试之前对模型组大鼠腹腔注射0.5 mg/ml的甲基苯丙胺。

研究表明1mg/kg的METH能够建立稳定持久的CPP模型[15-16]，并且此浓度进行条件配对的CPP模型，在CPP行为消退后可用0.5 mg/ml的甲基苯丙胺成功诱发复吸行为[17-18]。

2.4 实验设计

为了探索急慢性rTMS对METH诱导的条件性位置偏爱复吸行为的影响，我们设计了两个实验：

实验一：探索急性高频（10Hz）rTMS对大鼠CPP复吸的影响。将大鼠随机分成三组：(1) SAL组：生理盐水对照组；(2) METH + sham组（伪刺激组），CPP行为发生消退后，给予大鼠为期1天的伪刺激处理；(3) METH + rTMS组（真刺激组），CPP行为发生消退后，给予大鼠为期1天的真刺激处理。刺激结束后24 h，进行复吸测试。

实验二：探索慢性高频（10Hz）rTMS对大鼠CPP复吸的影响。将大鼠随机分成三组：SAL组、METH + sham组和METH + rTMS组，在CPP行为发生消退后，对METH + sham组进行为期3天的伪刺激处理，而对METH + rTMS组进行为期3天的真刺激处理。刺激结束后24 h，进行复吸测试。

刺激参数及真假刺激方式见下文。两次实验的条件都是对照严格一致的，实验大鼠数量、体重、生理盐水对照组、实验流程、实验环境等都是严格一致的。也就是说，两次实验，除了最后rTMS的刺激天数不同，其余均在同一条件下进行。

2.5 rTMS仪器与刺激方案

rTMS刺激仪器和线圈购自武汉依瑞德公司，其中线圈内径2.5 cm，外径5 cm。在实验中，急慢性rTMS刺激均是每日进行两次刺激，上下午各一次，每次给予500个刺激，中间间隔6 h，每日共计1000个刺激数。其中，刺激频率为10 Hz，刺激串为20，串刺激数为25，串间隔为15 s。刺激强度均为30%最大输出功率，相当于100% RMT。真刺激组大鼠在刺激时，使线圈中心紧贴头皮，对准大鼠颅骨顶；而假刺激组的线圈置于大鼠头顶上8 cm，确保大鼠能够感受到线圈的噪音但不会接收到磁场刺激。在刺激期间，用手固定大鼠，限制其运动。另外，为了排除刺激时的噪音及固定方式对大鼠产生应激反应，在实验开始前，我们每天对大鼠进行12 min的rTMS假刺激，连续刺激1周，使大鼠适应rTMS的操作程序。实验期间，rTMS真假刺激均不会导致大鼠发生癫痫或其他明显的行为异常。

2.6 数据分析与统计

实验数据采用prism 6.0 软件进行统计分析，应用双因素方差分析（two-way ANOVA)、Bonferroni post hoc多重比较检验对数据进行统计。p < 0.05代表有统计学差异。结果以均值（标准误）的形式呈现。

3．结果

3.1 0.5mg/ml的甲基苯丙胺能够成功诱发大鼠CPP的复吸行为

实验流程如表1所示，将实验大鼠随机分成3组：Con组(n=6)，METH 1组(n=6) 和METH 2组(n=5)，各组处理情况见图2A。

各组CPP得分及统计结果如表2a和表2b所示。研究表明，应用剂量为1 mg/ml的METH进行条件化训练，能够成功建立起甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱模型，经过消退训练后，腹腔注射0.5 mg/ml 的METH能够成功诱发大鼠的复吸行为（图2B），METH 2 vs. Con, t (42) = 3.31, p = 0.006; 而生理盐水则不能诱发，METH 1 vs. Con, t (42) = 0.79, p >0.999。

3.2 急性rTMS不能显著抑制CPP的复吸行为

各组大鼠在三次测试中的CPP得分及统计结果如表3a和表3b所示。结果表明，在大鼠的条件性位置偏爱行为发生消退后，给予1天的rTMS处理，能够在一定程度上抑制成瘾大鼠的复吸行为，但差异没有统计学意义（图3C），METH + rTMS vs.METH + sham, t (72) = 1.48, p = 0.431。

说明急性rTMS对成瘾大鼠的复吸行为可能具有一定的抑制作用，但是否有效需要进一步地探索。

3.3 慢性rTMS能够显著抑制CPP的复吸行为

各组大鼠在三次测试中的CPP得分及统计结果见表4a和表4b。结果提示，大鼠的条件性位置偏爱行为发生消退后，连续给予3天的rTMS处理，能够抑制成瘾大鼠的复吸行为（图4C）：METH+rTMS vs. SAL, t (69) = 0.63, p > 0.999; METH + rTMS vs. METH + sham, t (69) =3.33, p = 0.004。

表1．大鼠条件性位置偏爱复吸模型实验流程

由此说明，慢性rTMS能够抑制甲基苯丙胺成瘾大鼠的复吸行为。

4．讨论

4.1 主要发现

物质成瘾目前被认为是一种病理性的学习记忆过程。成瘾物质会使成瘾者的大脑结构和功能发生改变，使得成瘾者在戒断期对药物相关线索异常敏感，极易产生渴求，诱发复吸行为[19]。

条件性位置偏爱实验是目前评价药物精神依赖性的经典实验模型，是一种基于巴普洛夫条件反射的学习记忆过程[20]。该成瘾模型能够很好地模拟现实中人的成瘾情况，主要包括三大阶段：成瘾记忆的形成、消退和复吸。这种基于巴普洛夫条件反射形成的成瘾性记忆非常牢固，而消退性记忆则较脆弱，因而在CPP消退后，当动物再次接触药物相关线索时，会很容易诱发出复吸行为[21]，如图2所示。

大量研究表明，rTMS刺激大脑时，可以引起突触可塑性的改变，表现为长时程增强（long-time potentiation, LTP） 和 长 时 程 抑 制 (long-time depression，LTD)。目前一些理论认为，rTMS的这种作用效果主要与刺激频率和刺激强度密切相关，高频刺激会诱发LTP，而低频刺激则会诱发LTD[6,22]。而本研究在条件性位置偏爱行为发生消退后，对大鼠进行高频rTMS刺激，结果发现慢性高频rTMS能够抑制成瘾大鼠的复吸行为。这可能是因为高频磁刺激诱发的LTP作用，增强了大鼠的消退性记忆，从而预防了复吸行为的发生。而急性高频磁刺激虽然没能成功抑制住大鼠的复吸行为，但与假刺激组相比，有一定的抑制趋势。结合实验一与实验二，说明rTMS的这种抑制作用需要足够的磁刺激量。

图2．METH（0.5mg/ml）成功诱发大鼠条件性位置偏爱的复吸行为

表2a．CPP复吸模型，三组大鼠三次测试之间的比较

表2b．CPP复吸模型，各组大鼠CPP得分比较

图3．急性rTMS处理对CPP复吸行为的作用

表3a．实验一，三组大鼠三次测试之间的CPP得分比较

表3b．实验一，各组大鼠CPP得分组内比较

图4．慢性rTMS处理对CPP复吸行为的作用

表4a．实验二，各组大鼠三次测试之间的CPP得分比较

表4b．实验二，各组大鼠CPP得分组内比较

4.2 研究局限性

首先，本研究进行了一次复吸测试，如有可能，还可以往后每隔几天再测一次，观察rTMS刺激的持久性。其次，因实验条件的局限性，一批实验能做的大鼠数量有限，本来可以通过一次实验来检测急慢性rTMS对复吸行为的作用，但本研究分成了两个实验来探索。第三，本研究中rTMS刺激参数是通过参考多个实验研究最终制定的。该研究目前仅仅探索了高频磁刺激对CPP复吸行为的影响，但是其他刺激模式如低频刺激等对复吸行为的作用还有待进一步探索。

4.3 研究意义

本研究分别探索了急慢性rTMS对甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱复吸行为的影响，发现rTMS能够抑制成瘾的复吸行为，为日后临床上应用rTMS治疗物质成瘾提供一个初步的理论基础和依据。未来的研究可以结合临床研究探索不同rTMS刺激模式对物质依赖的影响及其作用机制。

资金来源

国家重点研发计划“重大慢性非传染性疾病防控研究”（2017YFC1310400），国家自然基金联合基金重点项目（U1502228），国家自然科学基金（81771436），上海市卫生计生委联合攻关及适宜项目（2014ZYJB0002），上海市科技人才计划项目（17XD1403300），上海精神障碍重点实验室（13DZ2260500），上海市卫生和计划生育委员会（精神病学）重点学科（2017ZZ02021）。

利益冲突

本研究不涉及任何利益冲突。

伦理审批

中国科学院动物保护与使用委员会批准本研究。所有实验操作均严格遵循实验动物管理委员会批准的《实验动物研究方案》。

作者贡献

武学庆设计实施本实验，并完成初稿。

居云悦、焦东亮参与实验设计和数据分析。

赵敏负责实验设计和稿件修改。

所有作者阅读并同意终稿的发表。