刘存霞 ，费亦东 ，王锐 ，吴静 ，田雪 ，赵巧雅 ，路晓 ，马秀丽 **

（1.山东省农业科学院家禽研究所 家禽疫病诊断与免疫重点实验室，山东 济南 250023；2.吉林大学动物医学学院，吉林 长春 130122；3.山东天牧生物科技有限公司，山东 东营 257500）

鸡传染性法氏囊病（IBD）最早是由Cosgrove于1957年在美国甘布罗镇的肉鸡群中发现的，目前该病已呈世界性流行。据报道IBDV分为两种血清型，血清Ⅰ型对鸡致病，Ⅱ型对火鸡致病，目前报道的鸡的IBDV疫苗毒、强毒株均属于血清Ⅰ型。该病毒主要侵害禽类的免疫中枢腔上囊而导致鸡本身免疫机能障碍，从而增加对其他病原如禽流感、新城疫、细菌、支原体的易感性，虽然IBDV本身的致死率不高，因其破坏家禽的免疫系统，仍需从根本上加强对IBD的防制。近年来IBD临床病例减少，本试验在吉林省内分离鉴定了IBD分离株，为该病的流行病学及防制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品、试验动物和试剂 病料为2007年采自吉林大学动物医院临床送检病死鸡的法氏囊、脾脏，SPF（Specific pathogen free）鸡胚购自哈尔滨兽医研究所由本实验室自行孵化，CEF细胞由军事兽医研究所病毒室制备。

IBDV琼脂免疫扩散试验阳性抗原、血清购自中国兽医药品监察所。Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、Oligodt、 鼠源反转录酶、PCR产物连接试剂盒pMD18-T载体、T4DNA连接酶、BSA、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗鸡IgY、RNA酶及各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司和 Promega公司；RNA提取试剂盒TRIzol Reagent购自美国MD公司产品；PCR产物胶回收试剂盒为Axygen公司产品。

1.2 引物设计 根据Mundt E等报告的IBDV cDNA序列及GenBank已发表的IBDV序列，在同时编码VP5和VP2两种蛋白质的重叠基因保守性区设计一对引物（P1、P2）。

P1：5'-GGTCGGAGACTTCAACCTAC-3' ；P2：5'-TGAGAATTGGTAATCATCGG-3' ，扩增片段为536bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 病料处理 无菌条件下取法氏囊，放入灭菌的西林瓶中用剪刀剪碎后转入玻璃研磨器中研磨，按1：5的比例加入灭菌生理盐水，同时加入双抗（终浓度 100μg/μl），于 4℃冰箱放置 2～4h，反复冻融三次，3000r/min离心15min取上清液，再经0.22μm滤器过滤除菌置-20℃保存备用。

1.4 RT-PCR检测 取处理好的组织浸出液，用TRIzol Reagent试剂盒提取组织总RNA。依次加入 Rnase Free ddH2O 8μl、随机引物 9mers 1μl、病毒 RNA 提取物 6μl，75℃ 5min，然后置于冰 盒 上 依 次 加 入 RNase Free ddH2O 5.5μl、5×RNA PCR Buffer 6μl、dNTP Mixture （10mmom/L）1.5μl、RNase Inhibitor 1μl、M-MLV 反转录酶 1μl，42℃孵育60min，95℃灭活5min完成反转录。配制25μl PCR 反 应 体 系 ：10×Ex Buffe 2.5μl、dNTPs(10mM)0.5μl、ExTaq 酶 0.25μl、上游引物（20pM）、下游引物（20pM）各 0.5μl，上述 cDNA 4μl，补水至 25μl，PCR 反应条件为：94℃预变性 3min；94℃变性 30s；55℃退火 30s；72℃延伸 40s；30 个循环，72℃再延伸 10min。

1.5 目的片段克隆测序 PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，用回收试剂盒对目的片段进行回收纯化与pMD18-T载体连接过夜，转化感受态DH5α细胞。提取重组子的经酶切鉴定阳性样品送TAKARA宝生物大连有限公司进行测序。然后将所获的序列在NCBI的Gene Bank中进行核酸序列比较。

1.6 病毒的分离与传代 病毒在鸡胚中传代：取研磨液经鸡胚绒毛尿囊膜接种SPF鸡胚，0.1ml/胚，用医用胶布封住卵窗并用石蜡封之。鸡胚接种后，横卧于温箱中，不许翻动，保持卵窗向上。用检卵灯每天检卵一次，弃去24h内死亡的鸡胚，37℃恒温培养至144h，将死亡鸡胚置4℃冷藏，收集尿囊膜经研磨、反复冻融3次后过滤除菌，连续传代3～5代直至在鸡胚接种后产生规律性病变。

病毒在CEF中传代：取鸡胚毒接种单层鸡胚成纤维细胞（CEF），37℃ 5%CO2培养 3～5d，收获细胞毒经反复冻融3次，继续在CEF上接种传代，连续盲传数代直至出现明显的规律性细胞病变。

1.7 毒价测定 将 CEF制成 1.0～1.5×106/ml细胞悬液，以106个/ml细胞加入到96孔板中制成单层细胞，将分离株细胞毒以10-4～10-9系列稀释，分别接种CEF细胞与9～11日龄的SPF鸡胚，重复3次，按照Reed-Muench法分别计算其对细胞和鸡胚的 TCID50/0.1ml、EID50/0.1ml。

1.8 血清学鉴定 进一步验证分离株特异性，参照中华人民共和国国家标准GB/T 17999.4-1999进行SPF鸡琼脂扩散试验及血凝试验。

1.9 电镜观察 收集新鲜制备的病毒液，用铜网在混合均匀的样品管中蘸取少量液体，用滤纸吸干铜网周边的液体，晾干后滴上一滴磷钨酸染液，作用1min后，用滤纸吸干，在透射电子显微镜下进行观察、拍照。

1.10 间接免疫荧光法检测（IFA） 将细胞适应毒接种于含CEF细胞单层的爬片上，同时设正常细胞对照，37℃，5%CO2培养至细胞出现明显病变后，取出玻片用 PBS（pH7.2）洗涤一次，2%戊二醛固定玻片 15～30min，PBS冲洗 3次，每次5min；用含3%BSA的PBS 37℃封闭2h，加入一抗（1：300稀释），37℃作用 2h，PBS冲洗 3次， 每次 5min；加入二抗（1：1000稀释异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗鸡IgY），室温避光作用1h，用PBS洗涤3次，每次5min，自然晾干；在载玻片上加一滴50%甘油PBS缓冲液，反扣于载玻片上于荧光显微镜下观察。

1.11 动物回归试验 取分离株的细胞毒接种28日龄的SPF鸡，每组30只，每只经滴鼻、点眼接种0.1ml，同时设空白对照5只，每天观察并记录发病情况，取法氏囊组织进行IBDV核酸检测。

2 结果

2.1 RT-PCR电泳结果 分离株IBDV经总RNA提取后进行RT-PCR，电泳可见536bp目的片段与预期大小一致。用本实验室保存的质粒pEX-IBDV-VP0作为阳性对照，电泳结果显示可获得536bp大小的目的片段，见图1。

图1 分离株RT-PCR产物电泳图

2.2 目的基因克隆及序列比对 RT-PCR扩增片段与pMD18-T载体连接后，克隆到感受态菌体中，从而获得重组质粒，经PCR电泳，结果获得与预期目的大小一致的536bp片段，如图2。所得的基因序列与NCBI中的Gene Bank中的核酸序列进行比较，同源性99%。

图2 重组质粒PCR产物电泳图

2.3 鸡胚稳定性试验 病料悬液接种9～11日龄SPF鸡胚后，可造成鸡胚死亡。连续盲传至第5代时，IBDV分离株适应鸡胚，鸡胚死亡时间集中在44～96h，并逐步趋于稳定呈现一定的规律，病变部位及程度也出现明显的规律性。剖检死胚可见绒毛尿囊膜增厚水肿，死亡胚体周身水肿，发育不良，体表有明显的出血现象，以头部、背部、腿部出血较严重，肝脏肿大并有灰白色坏死灶，肾脏轻度肿胀，如图3所示。

图3 接种分离株IBDV 44～96h死亡的SPF胚

2.4 IBDV分离株在CEF中的稳定性试验 IBDV分离株在CEF细胞中盲传第6代时仍未出现任何细胞病变。直到第7代开始出现少量的细胞变圆、脱落的现象。继续盲传至第9代时开始出现明显的细胞病变，且病变发生时间逐渐稳定，显微镜下可以明显看到CEF细胞变圆、脱落、呈拉网状。如图4所示。结果表明，成功分离出IBDV，并使其适应CEF细胞。

图4 IBDV分离株接种CEF病变图

2.5 IBDV分离株毒价测定结果 将分离株分别在SPF鸡胚及CEF中测定毒价，按照Reed-Muench法分别计算出0.1ml尿囊膜悬液中病毒JL-01 的 EID50分 别 为 104.5/0.1ml、104.75/0.1ml、104.5/0.1ml。 TCID50分别为 107.43/0.1ml、106.75/0.1ml、106.5/0.1ml。

2.6 血清学鉴定结果 琼脂扩散试验结果显示分离株与IBD标准抗体之间出现明显的单一的一条白色沉淀线，而阴性对照未见沉淀线。血凝试验结果显示待检样本未见有红细胞凝集，而AIV、NDV阳性对照可见明显的红细胞凝集，表明无AIV、DNA污染。

2.7 电镜结果 在透射电子显微镜下可以观察到大小在60nm左右的、呈六边形的散在的病毒粒子，除了完整的病毒粒子，也可见空衣壳，见图5。

图5 IBDV病毒粒子电镜图

2.8 IFA检测结果 IFA检测结果显示，IBDV分离株感染CEF细胞后，经特异性抗体反应，在病变CEF细胞中可见明显的绿色荧光，而正常细胞对照无特异性荧光，见图6。

图6 IBDV分离株的间接免疫荧光法检测

2.9 动物回归试验结果 SPF鸡于接种后第3天开始出现IBD的典型临床症状：病鸡精神萎顿，羽毛松乱，下痢、共济失调。发病率100%，死亡率5%～20%。第4天开始死亡。剖检可见胸肌、腿肌有片状出血，法氏囊严重水肿，内含淡黄色胶冻样渗出物，褶皱粘膜面上有针尖状出血点，少数法氏囊弥漫性出血；胸腺萎缩，肾脏轻度肿胀、未见有尿酸盐沉积；盲肠扁桃体肿大出血；接种30只SPF鸡，死亡5只，死亡率为16.7%，对照组均未见明显变化，见图7。取法氏囊按1.3病料处理方法经PCR检测为阳性。

图7 SPF鸡接种后出现IBD的典型临床症状

3 分析与讨论

本试验参照周蛟[1]的方法在吉林长春地区对IBDV进行分离。Saijo K[2]研究认为，对法氏囊病毒的分离要经过在鸡胚上的增殖后，才能适应CEF。李汉秋等将北京IBD-CJ801株IBDV经CEB传9代，CEK传8代，再在CEF上传4代后，培育出了一株IBDV 毒株，毒价为 106.5～107.6TCID50/0.1ml。现在大多数实验室都用CEF增殖IBDV，但并不是所有分离株都能适应于CEF[3]。本研究利用鸡接种5代次取鸡胚适应毒经CEF培养盲传，盲传至第7代开始出现少量细胞圆缩，继续在CEF细胞中传代至逐渐适应CEF细胞并产生有规律的CPE，通过对分离株的毒价测定，本试验分离的IBDV的毒价与李汉秋在北京分离的病毒毒价相近。

研究发现国内散在IBDV强毒株感染[4-6]，由于传染性法氏囊病是一种免疫抑制病，临床中常因免疫失败导致其他疫病感染的敏感性提高，本试验在吉林地区分离了IBDV，并对其进行了鉴定，拟用分离的IBDV株作为攻毒毒株检测实验室自行构建的鸡痘病毒载体活疫苗的免疫保护作用，为构建的重组鸡痘病毒活载体疫苗及其免疫保护性研究奠定了基础，对评价重组鸡痘病毒活载体疫苗对环境中IBDV的保护性研究具有重要的意义。