郑 斌 ，王 舒 ，王子迎 ，董华泽 ，谢 冬 ，王方阔 ，田 恒 ，陈 蕾 ，桂立新

（1.合肥师范学院化学与化学工程学院，安徽合肥 230061；2.金寨县大别山林艺植物科技开发有限公司，安徽六安 237300）

酵素是一种由氨基酸组成的具有特殊生物活性的物质，它是一种存在于所有活的动植物体内的必需物质，有着维持正常机体功能、食物消化、组织修复等生命活动的功效。酵素又叫做“酶”，几乎所有的生命活动都有它参与：问题的思考，运动，睡眠，呼吸，愤怒，哭泣或者荷尔蒙的分泌等都是以酵素为中心的活动结果[1]。如果没有酵素的参与，将无法进行生化反应，而对机体来说五大营养素（碳水化合物、类脂质、蛋白质、维生素、矿物质）都将变的毫无用处，生命现象也将会停止。所以，酵素对生命来说至关重要，更有甚者很多人将它称为“活着的物质”“掌握所有生命活动的物质”。酵素像催化剂一样的催化作用催动着机体的生化反应，催动着生命现象的进行。生物体内的化学变化，几乎都要在酵素的催化作用下进行，它带动原本不会发生的化学反应，也可加速化学反应而不需改变本质。酵素的种类繁多，有些酵素会把蛋白质分解成较单纯的化合物，其他的酵素则会再将这些化合物分解成更单纯的物质，直到分解成氨基酸为止，最后变成水和二氧化碳。

蓝莓，杜鹃花科植物，原生于北美洲和东亚地区，因含有的氨基酸，维生素，花青素，黄铜，有机硒，熊果甙和果酸等特殊营养成分是任何植物所无法比拟的，有着比一般植物更加优越的抗氧化活性，因而被誉为“世界水果之王”。蓝莓具有解除眼部疲劳，延缓衰老，增强记忆力，促进心血管健康，预防癌症等药性功效，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一。长白山蓝莓产地多集中在吉林省长白山地区的靖宇县，抚松县，长白山保护开发区等地，优越的自然资源赋予了长白山蓝莓饱满的浆果果实和独特的鲜美味道，其经发酵后的蓝莓酵素更是功效甚佳[2]。现市场上研究蓝莓酵素的成熟理论主要是关于蓝莓酵素在天然发酵过程中抗氧化能力的变化。是以还原力、羟基自由基清除能力、超氧自由基清除能力和DPPH自由基清除能力以及ABTS自由基清除能力为指标,多体系地考察发酵过程中抗氧化性能的变化,并进行相关性分析。最终结论表明，蓝莓酵素在发酵过程中体现了高抗氧化性能，抗氧化性能基本呈现上升趋势，与酚类物质含量相关性较大[3]。现如今市场上关于酵素的研究多关于微生物酵素和酵素粉，已成熟的多也是关于酵素的发酵过程中的抗氧化能力的变化。而蓝莓酵素作为由果蔬发酵而成的酵素液关于其含量研究的并不多。而本论文对蓝莓酵素的研究就是关于酵素中蛋白质和蛋白酶成分的测定，进行判定这批蓝莓酵素中蛋白质和蛋白酶的含量标准。因此对于蓝莓酵素的研究具有重要意义。

1 实验部分

1.1 蛋白质检测方法原理

考马斯亮蓝法[4]测定蛋白质浓度，利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度，是一种快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250如图1在不同的状态下有着两种不同的颜色形式，蓝色和红色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收光谱在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收谱在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm波长处的OD值与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

图1 G-250

蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在大约2min的时候会达到平衡，反应的完成也十分迅速，其结合物也在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物存在很高的消光系数，会让在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，能测微克级蛋白质含量[5]。

1.2 蛋白质检测试剂

0.1 mg/ml标准蛋白质溶液（25mgBSA定容至250ml容量瓶中）

考马斯亮兰G-250染料试剂;95%的乙醇：47.5ml无水乙醇加2.5ml的水。

实验器材：可见光分光光度计、旋涡混合器、试管16支，烧杯，玻璃棒，250mL容量瓶、1L容量瓶、分光光度计，移液管。

1.3 蛋白质检测步骤过程

0～1mg/100ml标准曲线的制备：（用移液管取）取8支离心管，编号后，按表1加入试剂，盖塞后，将各试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止10min后，以管一为空白对照，在595nm下比色测定。以标准维生素C含量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。

表1 不同含量的标准蛋白质溶液在595nm处吸光度

将标准1号设为空白校正，用标准6号测最大吸收峰，最大吸收峰的波长为594nm，先测标准溶液的吸光度，绘制标准曲线。再将1～6号酵素原液均量取0.1mL加0.9ml去离子水稀释到试管中。用移液枪取。均再加5ml考马斯亮蓝，摇匀。利用分光光度计依次测其吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量（表2）。

表2 不同组样品在595nm处吸光度

计算：通过蛋白质标准溶液的光谱图得在594nm处有最大吸收峰，在595nm处测得不同含量的蛋白质标准溶液的光密度，得出标准曲线。之后对样品进行紫外光谱测定，对比标准曲线图得到样品中的蛋白质含量。

1.4 蛋白酶检测方法原理

福林法[6]：通过10ug/ml酪氨酸溶液和蒸馏水配制各种不同浓度的酪氨酸溶液，然后通过紫外分光光度计长出溶液的最大吸收波长，之后通过最大吸收波长求出在最大吸收波长处的吸光度，并给出标准曲线。再通过样品对2%蛋白酶的分解量进行紫外分光光度计分析并与给出的标准曲线进行比对，得出样品中蛋白酶的含量。

1.5 蛋白酶检测试剂及器材

福林试剂：福林酚以加入一倍蒸馏水的量进行使用。

0.4 mol三氯乙酸（TCA）溶液，0.4mol碳酸钠溶液，pH7.2磷酸盐缓冲液，2%酪蛋白溶液，100ug/ml酪氨酸溶液。

分析天平，光电比色计或分光光度计，水浴锅，移液管。

1.6 蛋白酶检测步骤与过程

各种不同浓度的酪氨酸溶液配制见表3：

表3 不同浓度酪氨酸配制

表4 不同浓度酪氨酸的光密度测定

样品的平均光密度（OD）-空白的平均光密度（OD）=净OD值[7]。

取6只试管并编号，按照表3各吸取不同浓度酪氨酸1ml，各加入0.4mol碳酸钠5ml，再分别加入已稀释的福利试剂1ml。摇匀后放置于水浴锅中。在40℃温度下保温发色20min，然后在紫外分光光度计上分别测定光密度（OD值），减去1号管（蒸馏水空白试验）所测得的OD值为净OD值。并列表4列参数：试剂，按表3制备的不同浓度酪氨酸，ml（均为 1），0.4mol/l碳酸钠，5ml，OD 值（1，2，3平均），净 OD值。样品稀释液的制备：取样品发酵液1ml加入9ml蒸馏水。样品测定：取 15×100mm 试管 3 支，编号 1、2、3、（2 只也可），将样品稀释液向每管内加入1ml，置于40℃水浴锅中水浴预热2min，再分别加入酪蛋白1ml并经同样预热，精确保温10min，一到时间，立即再分别加入0.4mol三氯乙酸2ml，以结束反应，继续放于水浴锅中水浴保温20min。离心或过滤沉淀后的残余蛋白质，再重新取15×150mm试管三支，编号1、2、3，分别加入滤液1ml，再加0.4ml碳酸钠5ml以及稀释后的福林试剂1ml，并摇匀。40℃水浴锅水浴保温发色20min后测定光密度（OD值）。空白试验液取3支试管，编号，测定方法和上述一样，只是在加入酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2ml，让酶失去活性，再加入蛋白酶。基于方便起见，分别列出表5样品和空白实验准备和表6样品和空白实验的光密度测定。

表5 样品和空白实验准备

表6 样品和空白实验的光密度测定

计算：在 40℃下每分钟水解酪蛋白产生lug酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位[8]。

样品蛋白酶活力单位（干基）=A/10×4×N×1/（1-W）

式中：A-样品所测OD值，根据标准曲线得相当的酪氨酸微克数（或OD值× K）；

4——4毫升反应液取出1mL测定（即4倍）；

N——酶液稀释的倍数；

10——反应10min；

W——样品水分百分含量[9]。

2 结果分析

2.1 蛋白质检测结果

实验结果可得蛋白质标准溶液在最大吸收光谱处的光密

表7 蛋白质标准溶液在最大吸收光谱处的光密度

表8 样品溶液在最大吸收光谱处的光密度

两组数据的平均值分别为：25.5238mg/ml；27.0640mg/ml

两组数据的标准差分别为：7.2171；6.1382度如表7。

由表7得回归方程为，C=-26.3899×A+38.1927

其中为单波长法，λ=594 nm 单位（mg/ml）

测得样品溶液在最大吸收光谱处的光密度如表8并通过回归方程求得含量。

图2 定量分析报告

2.2 蛋白酶检测结果分析

样品溶液通过紫外分光光度计测得在最大吸收峰740nm处的吸光度如下图2中所示，通过配制的已知浓度的不同酪氨酸溶液在740nm的吸光度得出标准曲线也如下图。然后通过紫外分光光度计对样品溶液在740nm处的测定，得出吸光度，对比标准曲线得到样品溶液中所含蛋白酶的含量浓度。所测结果相似性是因为这是同一批次在同一实验条件的实验测定，所以对比实验中吸光度虽有小的差异，但根据标准曲线的取得原则择优之后标准曲线并无变化，即多组实验所得标准曲线并无太大区别，所得最后结果也几近相同，故而分析这一批次的某一组数据进行代表表征。并且通过下图2分析可得这组数据的平均值为23.939ug/ml；标准差为：2.4202。

3 结论

蓝莓酵素中含有丰富的蛋白质和蛋白酶，从而使酵素有着良好的分解作用和促进新陈代谢作用以及净化血液的作用。通过对样品-发酵液的稀释液中蛋白质和蛋白酶含量的测定，经过实验，得到数据处理分析后得出了这一批次中两组蓝莓发酵液的蛋白质含量平均值分别为25.5238mg/ml；27.0640mg/ml；两组数据的标准差分别为7.2171、6.1382。这组蓝莓发酵液的蛋白酶含量平均值为23.939ug/ml；标准差为2.4202。此项研究为大家提供一种可以借鉴的道路，以后可按照这种方法对蓝莓酵素中蛋白质和蛋白酶含量进行测定。