朱明明,何鸿举,*,樊明涛,冉军舰,马汉军

(1.河南科技学院食品学院,河南新乡 453003;2.西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌 712100)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)又名醋柳、酸棘、沙枣等[1],起源于欧亚大陆,而后种植于许多国家,包括罗马尼亚、印度、中国、尼泊尔、巴基斯坦、德国、芬兰、法国等[2]。沙棘果因其富含微量元素、油脂及其化合物、维生素C、类胡萝卜素、多酚等[3-4]而备受关注。其中沙棘多酚,尤其是黄酮类物质具有抗氧化、抗炎、护肝及提高免疫力等重要作用[5-6]。有研究表明沙棘果可治疗多种疾病,包括心血管疾病和癌症等[7-9]。因此开发沙棘功能性食品成为当前的研究热点。

沙棘果经发酵或半发酵酿造成低度沙棘果酒,具有一定的生理功能如抗氧化特性[10-11],有研究表明果酒的高抗氧化性可降低慢性病的病发率,包括冠心病、中风和癌症[12]。然而,由于沙棘果中富含有机酸,导致沙棘果酒存在着酸涩和香味寡淡等缺陷而不被消费者所接受[13]。有学者通过苹果酸-乳酸发酵来改善沙棘果酒酸涩的问题[14]。针对香味寡淡的问题,有研究通过生物、化学手段催化沙棘果酒中富含的类胡萝卜素(4.075 mg/L)[15]部分降解产香来实现[16-17]。利用类胡萝卜素降解产香的作用依据是由于类胡萝卜素除了自身具有抗氧化、抗癌、保护视力等功能特性[18-19]外,还可氧化降解生成将异戊二烯类香气物质[20],如β-大马酮和β-紫罗兰酮等,其在水中具有极低的香气阈值及特殊香气表征而成为果酒香气中必不可少的成分[21]。但关于添加葡萄球菌在沙棘果酒中,以达到催化类胡萝卜素降解产香的报道几乎没有。

本课题组从沙棘中首次分离得到一株高效降解类胡萝卜素的菌株TS-82,鉴定为巴氏葡萄球菌(GenBank Accession No. KP171185)[22]。研究表明其不具备致病性[22],可用于食品加工中,其所产类胡萝卜素降解酶可催化类胡萝卜素降解产香[23-24]。因此将巴氏葡萄球菌TS-82联合酵母菌发酵酿造沙棘果酒,结果表明部分类胡萝卜素降解,并产生特征性的香气物质,有效改善沙棘果酒的风味[25]。本文在此基础上,研究巴氏葡萄球菌TS-82联合酵母菌发酵(方法Ⅱ)、添加类胡萝卜素降解酶发酵沙棘果酒(方法Ⅲ),与传统发酵方法(方法Ⅰ)相比,对沙棘果酒理化性质、多酚含量、黄酮含量及抗氧化性的影响,以期在改善果酒风味的同时,确保适口、安全、营养丰富,研制出受消费者欢迎的新型沙棘果酒。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

巴氏葡萄球菌TS-82(StaphylococcuspasteuriTS-82) 西北农林科技大学食品发酵与生物技术实验室分离保存;酿酒酵母 西北农林科技大学食品发酵与生物技术实验室保藏菌种;沙棘果汁 采自青海的新鲜沙棘果经压榨而成;没食子酸、芦丁标品 购自Sigma-Aldrich;福林酚试剂 购自北京索莱宝;葡萄糖、NaOH、无水碳酸钠、二硝基水杨酸(DNS)、酚酞、亚硫酸、硫酸亚铁、果胶、水杨酸、DPPH、无水乙醇、HCl、铁氰化钾、三氯乙酸、一水合没食子酸、邻苯二甲酸氢钾等 均购自天津科密欧。

UV-2000型紫外-可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;cp2245型分析天平 Sartorius(德国)公司;恒温振荡培养箱 福玛(上海)实验设备有限公司;HH恒温水浴锅 科伟永兴(北京)仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅 博迅实业(上海)有限公司;低温离心机 中科中佳(安徽)科学仪器有限公司;pH计 精密科学仪器(上海)有限公司;R-120型旋转蒸发器 BüCHI(瑞士)公司;手持糖度仪 泉州光学(福建)仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 巴氏葡萄球菌TS-82培养液的制备 参照樊明涛[25]等的方法制备发酵液,具体如下:改良查氏液体培养基:K2HPO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,KCl 0.5 g/L,NaNO33 g/L,蔗糖30 g/L,番茄汁20 g/L,酵母浸粉3 g/L。121 ℃下灭菌20 min后备用。将TS-82菌株接种于上述灭菌培养基中,在37 ℃、130 r/min条件下培养至对数生长末期,4 ℃下保存备用。

1.2.2 酿酒酵母培养液的制备 参照樊明涛[25]等的方法制备发酵液,4 ℃下保存备用。

1.2.3 类胡萝卜素降解酶的制备 类胡萝卜素降解酶:参照朱明明等[26]的方法制备类胡萝卜素降解酶酶粉,4 ℃下保存备用。

1.2.4 沙棘果酒的酿造

沙棘果汁经巴氏杀菌后,冷却至室温,添加白砂糖调节可溶性固形物(TSS)含量至16%,接着分别采用三种发酵方式,酿造三种不同类型的沙棘果酒:Ⅰ是添加酿酒酵母(4%)进行发酵,Ⅱ是添加酿酒酵母(4%)和巴氏葡萄球菌(2%)共同进行发酵,Ⅲ是添加酿酒酵母(4%)和类胡萝卜素降解酶(1%)共同进行发酵。

操作要点:a、采用巴氏杀菌,除去其他杂菌,操作条件为68～70 ℃杀菌30 min;b、酿酒酵母接种时,将1.2.2制备得到的酵母培养液取出,离心后去掉上清,加入少量沙棘果汁,于28 ℃下培养2 h,使酵母适应环境后接入沙棘果汁;c、TS-82菌株接种时,同样地,将1.2.1所制备的培养液取出,离心后去掉上清,加入少量沙棘果汁,于37 ℃下培养2 h,使TS-82适应环境后接入沙棘果汁;d、添加类胡萝卜素降解酶时,取1.2.3制备的500 μg/L酶粉加入沙棘果汁;e、主发酵为15 d。

1.2.5 理化指标测定 pH:利用pH计进行测定;可溶性固形物:利用手持糖度计进行测定;还原糖:利用DNS比色法测定[27];酒精度:参考GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[28]利用酒精度计进行测定;滴定酸:参考GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[28]利用NaOH中和滴定法测定;微生物指标:参考GB/T 4789.25-2003《食品卫生微生物学检验 酒类检验》[29]测定菌落总数,并检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌三种致病菌。

1.2.6 总多酚含量测定 参照Chaovanalikit等[30]的Folin-ciocalteu法,略作修改,测定总多酚的含量。标准溶液的制备和测定:准确配制100 μg/mL的没食子酸标准溶液,分别稀释成浓度为0、10、20、30、40、50 μg/mL的没食子酸标液。分别取0.5 mL上述浓度的标液,加入2.5 mL蒸馏水与之混合,加入0.5 mL Folin-ciocalteu显色剂和1.5 mL7.5%的碳酸钠溶液,混合均匀。室温下避光反应2 h后,765 nm下测定吸光度值,并根据相应值绘制得到总酚的标准曲线为y=0.1208x+0.0021,R2=0.9998。以没食子酸表示总酚含量,单位为g/L(gallic acid计)。

样品测定:取0.5 mL样品溶液,加入2.5 mL蒸馏水与之混合,加入0.5 mL Folin-ciocalteu显色剂和1.5 mL7.5%的碳酸钠溶液,混合均匀。室温下避光反应2 h后,765 nm下测定吸光度值。蒸馏水作为空白对照。

1.2.7 总黄酮含量测定 标准曲线的绘制:采用60%乙醇溶解芦丁标准品,配制成浓度为1.0 mg/mL的标品溶液。分别取标品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL,采用上述方法进行反应后,以60%乙醇为空白对照,500 nm下测定吸光度值,绘制芦丁标准曲线为y=11.1211x+0.0250,R2=0.9991。以芦丁表示总黄酮含量,单位为mg/L(rutin计)。

样品测定:参考中国药典中NaNO2-Al(NO3)3显色法测定沙棘果酒中总黄酮含量。具体操作方法如下:取沙棘果酒样品2.0 mL,60%乙醇3.0 mL,5% NaNO2溶液0.3 mL,混合均匀放置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,混合均匀放置6 min,而后,加入4% NaOH水溶液4.0 mL,再加入60%乙醇定容至10 mL后,混合均匀,反应15 min后,以空白为对照,于500 nm下测定吸光度值,根据标准曲线计算总黄酮含量。

1.2.8 DPPH·清除率测定 参考Barba等[31]的研究方法测定DPPH·自由基清除率。将沙棘果酒样品稀释10倍后,取0.2 mL稀释液,加入1.8 mL蒸馏水,再加入2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液,室温下避光反应30 min后,以7%乙醇水溶液作为参比,于517 nm下测定其吸光度。空白用7%乙醇水溶液代替样品。依据如下公式计算:清除率(%)=[1-(Al-A10)/A0]×100%,其中A0:空白吸光值;A1:样品吸光值;A10:样品溶液本地的吸光值。

1.2.9 铁离子还原能力测定 参照Oyalzu[32]的方法测定还原能力。取0.2 mL样品,依次加入1.0 mL蒸馏水,2.5 mL 0.2 mol/L pH6.6的磷酸缓冲液,2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液。混合均匀后在50 ℃水浴下保温20 min,加入1.0 mL 10%的三氯乙酸,充分摇匀后3000 r/min离心10 min,取2.5 mL上清液,再依次加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液,700 nm下测定吸光度值,以蒸馏水为空白对照。

以上所有实验均为三次平行,取平均值。

1.3 数据处理

使用DPS软件(Version Rel.6.55,1997)对数据进行统计学分析。

2 结果与讨论

2.1 不同酿造方法对沙棘果酒品质的影响

2.1.1 不同酿造方法对沙棘果酒发酵过程中pH变化的影响 采用酿酒酵母传统酿造方法、巴氏葡萄球菌TS-82联合酿酒酵母、酿酒酵母发酵并添加类胡萝卜素降解酶三种酿造方式发酵沙棘果酒,其发酵液pH的变化结果如图1所示。由图1可知,经不同酿造方法处理后,沙棘果酒的pH均有显著性的下降(p<0.05)。而经方法Ⅱ、Ⅲ发酵得到的沙棘果酒与方法Ⅰ酿造的产品,在酒精发酵结束后(15 d)的pH并无明显变化(p>0.05),均在2.8～2.9的范围内,表明添加巴氏葡萄球菌TS-82或类胡萝卜素降解酶均不会影响酿酒酵母的发酵过程,对果酒的pH无影响。

图1 不同沙棘果酒酿造过程中pH的变化

2.1.2 不同酿造方法对沙棘果酒发酵过程中可溶性固形物(TSS)变化的影响 由图2可知,经不同酿造方法处理后,沙棘果酒的可溶性固形物含量随着发酵时间的延长均有显著性的下降(p<0.05)。同样,在酒精发酵结束时,其他两种方法处理后较传统方法所得的可溶性固形物含量无显著性差异(p>0.05),表明添加巴氏葡萄球菌TS-82或类胡萝卜素降解酶均不会影响酿酒酵母的发酵过程,对果酒的可溶性固形物无影响。

图2 不同沙棘果酒酿造过程中可溶性固形物的变化

2.1.3 不同酿造方法对沙棘果酒其他理化指标和微生物指标的影响 表1列出了经不同酿造方法在酒精发酵结束后得到沙棘果酒的其他理化指标和微生物指标。从表1中可看出,酒精发酵结束后还原糖的含量较沙棘果汁显著下降(p<0.05),但经三种酿造方法所得产品均无明显差异,残糖量分别为1.45、1.66、1.75 g/L,酒精度也都达到6%vol,表明加入巴氏葡萄球菌TS-82或降解酶均可使沙棘果酒与传统酿造的产品相一致,达到干酒的要求(残糖量低于4 g/L)。在发酵结束时,对滴定酸进行测定,结果发现滴定酸含量较果汁均有所增加(p<0.05),与2.1.1中pH降低相一致。对果酒和果汁中的微生物指标也进行了相应的检测,结果表明菌落总数均小于100 CFU/mL,未检测到金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌。上述结果说明,添加了巴氏葡萄球菌TS-82或类胡萝卜素降解酶得到的沙棘果酒的品质变化不大,在提高风味的同时,确保其适口性和安全性。

表1 沙棘果酒的理化指标

2.2 不同酿造方法对沙棘果酒发酵过程中总多酚含量变化的影响

由图3可知,经不同酿造方法发酵沙棘果酒的过程中,其总多酚含量呈现出先上升后下降再趋于平缓的趋势。整体而言,三种果酒均在第8 d总多酚含量达到最高,三种果酒在发酵结束时总多酚含量与沙棘果汁相比均显著升高(p<0.05),分析原因可能是在酿造初期,果汁中的多酚逐渐释放,而随着酿造时间的延长,多酚部分被氧化所造成的。方法Ⅱ所得沙棘果酒的总酚含量(9.3 g/L)较方法Ⅰ的结果(8.9 g/L)明显升高(p<0.05),这与之前研究的十种多酚总含量增加[25]的结果相符。方法Ⅲ所得沙棘果酒总酚含量(8.7 g/L)与传统方法Ⅰ的结果(8.9 g/L)无显著性差异(p>0.05),而低于方法Ⅱ所得总多酚含量,表明巴氏葡萄球菌TS-82对于沙棘果酒酿造过程中多酚的释放有一定促进作用,而类胡萝卜素降解酶则对多酚的释放及氧化无显著影响(p>0.05)。

图3 不同沙棘果酒酿造过程中总多酚含量的变化

2.3 不同酿造方法对沙棘果酒发酵过程中总黄酮含量变化的影响

由图4可知,经不同酿造方法发酵沙棘果酒的过程中,其总黄酮含量呈现出先上升后下降的趋势。整体而言,三种果酒均在第8 d总黄酮含量达到最高,与总酚的变化一致(p<0.05)。经酒精发酵结束后(15 d),三种方法所得沙棘果酒的总黄酮含量无显著性差异(p>0.05),较沙棘果汁(40 mg/L)均有所降低,但并无显著性差异(p>0.05),这与之前所做的槲皮素和芦丁含量有所降低的结果一致[25],分析原因可能是在沙棘果酒酿造环境中,相较于其他的多酚类物质,黄酮类物质更容易发生氧化所致。

图4 不同沙棘果酒酿造过程中总黄酮含量的变化

2.4 不同酿造方法对沙棘果酒发酵过程中DPPH·清除率的影响

经不同酿造方法所得沙棘果酒的DPPH·清除能力如图5所示。由图5可看出,经不同酿造方法得到的沙棘果酒与沙棘果汁相比,对DPPH·都有较好的清除能力(p<0.05),表明沙棘果是一类比较强的自由基猝灭剂,分析原因可能是由于其中含有的多酚类化合物具有较强的自由基清除能力。经方法Ⅱ所得沙棘果酒的清除DPPH·的能力比传统方法Ⅰ和方法Ⅲ得到的果酒清除能力都要强(p<0.05),方法Ⅲ和传统方法Ⅰ得到果酒的清除能力无显著性差异(p>0.05),这与多酚含量的增加相一致。整体而言,DPPH·清除能力也在第8 d达到最大,与总酚、总黄酮变化一致。

图5 不同沙棘果酒酿造过程中DPPH·清除率的变化

2.5 不同酿造方法对沙棘果酒发酵过程中铁离子还原能力的影响

图6是经不同酿造方法沙棘果酒还原能力的变化情况。由图6可知,三个实验样品的铁离子还原能力都呈现出先增强后下降,最后趋于平缓的趋势。同样地,在发酵第8 d,还原能力最大,而且添加巴氏葡萄球菌TS-82菌株的沙棘果酒的还原能力(88%)总体稍高于传统酿造的(85.2%)(p<0.05),这与前面的结果相一致。但是添加类胡萝卜素降解酶的沙棘果酒,其还原能力(87.6%)也高于传统酿造的(p<0.05),与添加巴氏葡萄球菌TS-82菌株的沙棘果酒的还原能力(88%)无显著性差异(p>0.05),这与其多酚含量的结果不太相符,表明铁离子还原能力并不完全随多酚含量的增加而增加,而与其中的多酚组成有关。

图6 不同沙棘果酒酿造过程中还原能力的变化

3 结论

与传统方法Ⅰ相比,方法Ⅱ、Ⅲ对pH、可溶性固形物、微生物等理化性质影响不大,且均无致病菌检出。应用方法Ⅱ,可显著提高总酚含量(9.3 g/L)(p<0.05),且DPPH·的清除能力(86.5%)和还原能力(88%)也有所提高(p<0.05)。应用方法Ⅲ,较传统方法Ⅰ,沙棘果酒总酚含量(8.7 g/L)和DPPH·的清除能力(84.7%)无显著性差异(p>0.05),还原能力(87.6%)有所增加(p<0.05);但与方法Ⅱ相比,其沙棘果酒总酚含量和DPPH·的清除能力(84%)均显著性下降(p<0.05)。因此,综合理化指标和抗氧化性,巴氏葡萄球菌TS-82联合酵母菌发酵的方式应用在沙棘果酒酿造中,在改善果酒风味的同时,有利于开发高抗氧化性的保健食品。