肖小芹 汤婉婷 成绍武 邓桂明

〔摘要〕 目的 比较研究棉签法、生理盐水冲洗法进行阴道涂片，HE染色法、瑞氏染色法、巴氏染色法染色对C57BL/6小鼠阴道涂片细胞组织染色的效果，为小鼠动情周期的确定寻找便捷、有效的检验方法。方法 对10只C57BL/6雌性小鼠分两笼饲养，每日10∶00用棉签法、生理盐水法进行阴道涂片，连续15 d，并使用HE染色法、瑞氏染色法、巴氏染色法，观察记录。结果 连续实验生理盐水法优于棉签法，HE染色染料易于获得；瑞氏染色分型清楚，染色佳；巴氏染色形态清晰，分色明显，透明度好。结论 大样本量旨在判断动情周期的发生与改变实验应采用瑞氏染色法，可辅以巴氏染色以增强实验动物数据资料的可靠性。

〔关键词〕 C57BL/6；动情周期；阴道涂片；HE染色；瑞氏染色；巴氏染色

〔中图分类号〕R34 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.003

〔Abstract〕 Objective To compare the staining effect of HE staining， Wright staining and Pap staining on the cell smear of C57BL/6 mice， and to find a relatively simple and effective staining method for identification of estrous cycle. Methods The 10 female C57BL/6 mice were taken vaginal smear at 10：00 every morning， with the course of 15 days. The results were analyzed by HE staining， Wright staining and Papanicolaou stainining methods. Results The normal saline method was better than swab method. HE staining method was simple and easy. Wright staining method was clear with obvious color separation. Papanicolaou stainining was with good diaphaneity. Conclusion The Wright staining method is firstly selected in large sample examination of mice vaginal smear for estimating the development of estrous cycle. The reliability of experimental information can be supplemented by Papanicolaou stainining method.

〔Keywords〕 C57BL/6； estrous cycle； vaginal smear； HE staining； Wright staining； Papanicolaou stainining

小鼠作為常用的实验动物之一，雌性小鼠广泛应用于生殖系统相关疾病研究[1]。小鼠动情周期的变化是评价生殖系统功能的一项重要指标，其性周期一般为4～6 d，可依据动物的性表现及生殖器官变化将动情周期分为动情前期、动情期、动情后期及动情间期[2]。小鼠生殖及内分泌系统随性周期发生一系列组织、生理学变化，进而体现在阴道细胞形态及比重的改变，因而，阴道涂片可简便快捷的体现动情周期而成为目前常用的判定小鼠性周期的方法之一[3]。但C57BL/6成年雌鼠体质量较小，性情较为暴躁，现有文献所述阴道涂片技术实际操作中存在一定问题，文献记载染色方法缺乏直观对比，本试验对C57BL/6小鼠阴道涂片方法进行优化，并对常用的三种染色方法进行比较研究，旨在建立快速、简单、可靠的阴道涂片方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取54～58日龄，体质量18～20 g，性成熟的C57BL/6雌鼠10只，SPF级，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供（实验单位使用许可证编号：SYXK（湘）2013-0005；许可证号：SCXK（湘）2016-0002）。

1.1.2 饲养条件 室内温度为23～27 ℃，相对湿度为45%～55%，明暗周期为12/12 h，分两笼饲养，试验期间自由饮用灭菌纯化水（灭菌方法：经121 ℃灭菌30 min，有效期14 d），食用标准普通维持饲料。

1.1.3 器材与试剂 OLYMPUS CH30型光学显微镜（北京城夕科技有限公司）。灭菌牙签，无菌脱脂棉球，10 μL移液枪、10 μL Tip头、玻片（载玻片、盖玻片）、医用生理盐水。Ehrilich苏木素液[4]（将苏木素2 g溶于100 mL纯乙醇，再将15 g钾明矾溶于100 mL蒸馏水中，溶解后将甘油倾入混合，然后加入苏木素乙醇混合液，最后加入10 mL冰醋酸，充分混匀后暴露在日光下自然成熟3个月），伊红染液[伊红Y（水溶）0.5～1 g，蒸馏水99 mL混匀]，瑞氏（Wright）染液[5]（瑞氏染料粉1 g放入研钵内，加中性甘油10 mL，研磨至细糊状时，慢慢加入600 mL甲醇，充分溶解，移至棕色瓶内1周后即可使用），磷酸盐缓冲液（10 g/L磷酸二氢钾30 mL，10 g/L磷酸氢二钠20 mL，蒸馏水加至1 000 mL），巴氏染色液Papanicolaou EA36（品牌：Solarbio，货号：G1612）。

1.2 方法

每日10：00对两笼小鼠分别使用自制棉签法及生理盐水冲洗法进行阴道涂片，并进行HE染色、瑞氏染色及巴氏染色。

1.2.1 阴道涂片 自制棉签法[1]：将牙签顶端尖锐处剪去，从脱脂棉球上撕取2 cm×2 cm大小棉絮，折叠缠绕于牙签顶端。将自制棉签于生理盐水中浸湿，插入小鼠阴道约5 mm，顺牙签缠绕方向旋转1周后取出，顺牙签缠绕方向于清洁载玻片上滚动1周。自然干燥玻片。

生理盐水冲洗法[6]：取10 μL移液枪，装10 μL Tip头后，吸取10 μL生理盐水，将枪头插入小鼠阴道约5 mm，吹打2～3次后吸出10微升，滴至载玻片，均匀铺开至1.5 cm×2 cm左右，自然干燥玻片。

1.2.2 HE染色 陰道涂片自然干燥后浸润苏木素染液染色5～10 min；流水冲洗；盐酸乙醇分色数秒（根据涂片染蓝色的深浅确定时间）；自来水浸泡返蓝5 min；伊红染液染色3 min；流水冲洗；干燥，封片，镜检[4]。

1.2.3 瑞氏染色 阴道涂片自然干燥后滴加瑞氏染剂数滴（按涂片面积大小而定），静置1 min（如天气炎热，时间应缩短，以防止染液干涸。若染液挥发，表面趋于干燥，应即增添染液）；加相当于染液1.5倍的磷酸盐缓冲液，与染液混匀，保持约10 min；流水冲洗（冲洗时应将玻片平放，缓缓加水，切勿先倾去染料，否则涂片易残留染料沉淀物）；干燥，封片，镜检[7]。

1.2.4 巴氏染色 阴道涂片自然干燥后放入95%乙醇固定3～5 min；85%乙醇2 min；80%乙醇2 min；70%乙醇2 min；流水冲洗；放入染色试剂盒内A：苏木素染色5 min；流水冲洗；B：蓝化液蓝化5 min；C：G6染液染色5 min；入95%乙醇分色数秒；D：EA36染液染色5 min；两次95%乙醇分色各数秒；干燥，封片，镜检。（此方法在染色试剂盒附说明书基础上根据试验情况进行了优化）。

2 结果

2.1 阴道涂片方法的选择

连续多日采集阴道涂片后，棉签组小鼠阴道口明显红肿，且操作速度相对较慢。移液枪组小鼠阴道口未见红肿，操作过程中未见阴道出血，且操作速度较快。

2.2 HE染色

细胞核被苏木素染成蓝紫色，角化细胞、细胞浆、嗜伊红颗粒等被伊红Y染成不同程度的粉红色，白细胞分叶核较明显。如图1。

2.3 瑞氏染色

细胞核被苏木素染成深蓝紫色，角化细胞、细胞浆等被染成不同程度的浅蓝紫色，白细胞分叶核较明显。如图2。

2.4 巴氏染色

细胞核被染成深蓝色，完全角化细胞胞浆染成橘黄色，不完全角化细胞被染成不同程度的粉红色，中间层、基底层表皮细胞被染成青色、蓝色，白细胞被染成蓝色且分叶核明显，形态结构清晰。如图3。

3 讨论

通过取材、染色、镜检分析，就阴道涂片方法而言，移液枪生理盐水冲洗法简便、高效，涂片污染少，新手易于操作。就阴道涂片染色方法而言，HE染色法技术成熟，染料易于获得，镜下动情间期易于辨别，但对角化细胞及中间层细胞区别较弱，取材部位过深易误判为动情前期或后期；瑞氏染色法步骤简略，操作便捷，省量节能，镜下动情期、动情间期明显，动情前期杂质易染色，故易于判断，但对鳞状上皮细胞角化程度区别度较小，取材部位对动情周期判断影响较小。巴氏染色对不同的细胞及不同分化程度的角化细胞染成不同颜色，分色明显，透明度好，便于鉴别、区分动情分期，且可排除取材过深的影响，实验结果准确，但操作较前复杂，成本较高。

综上，长时间连续涂片应采用生理盐水冲洗法进行阴道涂片取材。实验样本量大，旨在判断动情周期的发生与改变可应用瑞氏染色法；实验样本量小，旨在明确动情各期改变，或对阴道脱落细胞形态、比率进行研究时应采用巴氏染色法。临时染色、准确度要求较低时可采用HE染色法，但需注意采用棉签法，且取材不宜过深，防止细胞混杂。

参考文献：

[1] 秦 川，魏 泓.实验动物学[J].北京：人民卫生出版社，2015：164.

[2] 覃海章，肖胜军，华英杰，等.不同方法确定动情周期及动情期生殖器官结构[J].安徽医科大学学报，2017，52（11）：1650-1653.

[3] 宋孟秋，马永生，曹玉凤，等.小鼠发情周期中黄体大小及细胞的数量变化规律[J].动物医学进展，2015，36（11）：31-35.

[4] 高登慧，龚 宁，裴占阳，等.动物组织胚胎学实验指导[M].贵阳：贵州大学出版社，2014：60-65.

[5] 臧贵勇，张祥令，杨燕平.快速Wright液与改进的Wright液染色比较分析[J].重庆医学，2017，46（5）：676-677.

[6] 荆宝琴.成年SD大鼠不同阴道涂片方法探索[A].中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛论文集[C].中国毒理学会、湖北省科学技术学会，2015：1.

[7] JOHN D BANCROFT， MARILYN GAMBLE.组织学技术Theory and Practice of Histological Techniques：英文[M].北京：北京大学医学出版社，2008：105-108.