刘坚 毛红霞

【摘要】本文将小麦籽粒制成的全麦粉、小麦粉和干面筋作为分析对象，建立免疫亲和高效液相色谱分析全麦粉、小麦粉和干面筋中脱氧雪腐镰刀茵烯醇（DON）的检测方法，研究DON在分析对象中的分布变化规律。该方法采用免疫亲和柱净化，以甲醇：乙腈：水=10：10：80（V/V/V）为流动相，进样量100μL，回收率为74.7%～104.9%，相对标准偏差6.4%～12.3%，线性关系r值0.9995，方法检出限25μg/kg。检测分析结果显示，小麦制成小麦粉后相比较全麦粉，DON含量降低了88.4%～95.3%，制成千面筋后未检出DON。

【关键词】高效液相色谱；脱氧雪腐镰刀茵烯醇；全麦粉；小麦粉；干面筋

当今，食品安全是人类关注的焦点，而小麦作为国人的日常基础口粮和其他食品的原料，其质量安全又尤为显得重要。据有关调查研究显示，小麦易被禾谷镰刀菌、粉红镰刀菌、黄色镰刀菌等多种镰刀霉菌污染，产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）。小麦中检出DON的机率大多数超过了50%，部分国家和地区甚至已经达到了100%，小麦的衍生副产品中也检出了DON。脱氧雪腐镰刀菌烯醇是一类呕吐毒素，常常被称为“呕吐毒素”。该毒素具有一定的毒性，影响动物的生长和食物的吸收。家禽类动物或人类误食后可能引起呕吐、腹泻、内毒素血症，严重的甚至造成血小板缺乏症和神经系统紊乱。因此，我国《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2017）中规定了小麦、小麦粉中DON含量不得超过1000μg/kg。

目前DON的分析检测方法有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法等。但是薄层色谱法和酶联免疫吸附法均存在灵敏度差和重复性差的问题。高效液相色谱法由于前处理条件和仪器分析条件的差异，检测的准确性和灵敏度都有较大的差距，本文建立免疫亲和柱净化的前处理方法，建立用甲醇：乙腈：水=10：10：80（V/V/V）三元流动相体系，100μL大体积进样分析DON的新方法，分析检测全麦粉、小麦粉和干面筋中的DON含量，查找DON在小麦中的分布规律，优化小麦的商业用途，对保护人类食品安全有重大意义。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Agflent 1100液相色谱仪（配紫外检测器）：安捷伦公司；粉碎机：成都施特威公司；小型实验磨：德国布拉本德公司；面筋仪：瑞典波通公司；电加热干燥器：瑞典波通公司；高速均质器：飞利浦公司；玻璃纤维滤纸：英国Whatman公司；6位空气泵操作架：北京中检维康公司；电子天平：梅特勒公司；氮吹仪：无锡沃信公司；免疫亲和柱：美国Vicam公司。

色谱纯甲醇：中国国药；色谱纯乙腈：中国国药；聚乙二醇PEG8000：美国Vicam公司；超纯水：美国Millipore公司。

呕吐毒素标准储备溶液（纯度大于99.5%）：200.3μg/mL。

呕吐毒素标准工作溶液：取适量体积呕吐毒素标准溶液，氮气仪吹干后，用流动相（甲醇+乙腈+水/10+10+80）分别配制浓度为100μg/mL、300μgL、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、4000μg/L、6 000μg/L的DON标准工作溶液。

1.2试验样品

全麦粉：将小麦颗粒除杂后粉碎至80%以上过20目筛，筛上物和篩下物混匀制成全麦粉。小麦粉：将小麦颗粒除杂后用小型实验磨制成小麦粉。干面筋：按照GB/T 5506.2-2008和GB/T 5506.4-2008，将小麦粉洗成淡黄色的湿面筋，将湿面筋用电加热干燥器烘干后，即制成了干面筋，样品前处理时磨成粉末。

1.3样品处理

1.3.1样品制备

按照1.2制备试验样品。

1.3.2样品提取

称取25g试验样品和5g聚乙二醇PEG8000，用100mL乙腈水（80/20）溶于均质器中，以10000r/min的速度均质2min，静置2min，用玻璃纤维滤纸过滤提取溶液，收集澄清滤液于50mL比色管中。

1.3.3样品净化

连接免疫亲和柱于玻璃注射器下，准确移取2mL混匀的滤液于玻璃注射器中，连接空气泵和玻璃注射器，调节空气压力，使溶液以约1滴/s～2滴，s的速度通过免疫亲和柱，直至空气完全进入到免疫亲和柱中。用5mL高纯水淋洗免疫亲和柱，流速保持在1滴/s～2滴/s的速度，直至空气完全通过免疫亲和柱。准确加入1.0mL色谱纯甲醇到玻璃注射器中，淋洗免疫亲和柱并收集1.0mL全部样品洗脱液于玻璃测试管中。

1.3.4提取液定容

将1.0mL洗脱液用氮气仪吹干后，用300μL流动相（甲醇+乙腈+水/10+10+80）定容洗脱液，进高效液相色谱仪分析测定。

1.4仪器条件

色谱柱：AgilentC18 5μm4.6mmx250mm；流动相：甲醇：乙腈：水（V/V，10：10：80）；流速：0.8mL/min；进样量：100μL；柱温：30℃；检测器：紫外检测器；检测波长：218nm。

2结果与讨论

2.1试验条件的优化

2.1.1免疫亲和柱吸附能力的优化

DON免疫亲和柱对DON具有特异吸附性，当样品提取液通过亲和柱，样品中的DON会和亲和柱中的特异性抗体结合，而提取液中的其它组分或杂质不会与亲和柱结合，将随洗脱液流出，实现对提取液中DON的净化提取。免疫亲和柱净化技术虽然具有强特异性、高灵敏度、高回收率等特性，但是免疫亲和柱中的抗体是一定量的，一旦通过免疫亲和柱的样品量过大，无法保证样品提取液中DON完全被吸附，从而造成回收率较低。对免疫亲和柱进行不同含量呕吐毒素标准样品的吸附回收率试验，具体见图1。从图1中可知，免疫亲和柱的最高吸附DON的容量是1200ng左右，当样品中DON含量超过免疫亲和柱的最大吸附容量时，超过最大吸附容量的部分会流出亲和柱，导致回收率降低。

2.1.2流动相、流速和进样体积的优化

分别以三种不同的流动相甲醇水（V/V，40：60）、甲醇乙腈水（VN/V，10：10：800、乙腈水（v/v，dO：60）进行液相分析。实验结果显示，以甲醇/乙腈/水（V/V/V，10：10：80）为流动相时，很好地将雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行了分离，有效避免了杂质的干扰，其色谱峰的峰形优于其它流动相的峰形，无拖尾现象。同时随着流动相的流速增大，保留时间相应缩短，但峰形集中，柱前压较大，影响分离柱的使用寿命，0.8mL/min的流速完全能保证DON的分离。另外，大多数情况下使用20～50μL作为样品上机分析的体积，本实验将进样体积提高至100μL，既可以保证样品的峰形对称，又可以提高样品的检出限，因此将100μL定位样品的上机体积。在该条件下，标准品和样品的色谱图见图2和图3。

2.1.3样品洗脱液的优化

洗脱液直接以甲醇洗脱后的溶液进样分析，发现DON没有达到完全分离，出峰受到了干扰，甲醇洗脱定容后用氮气吹干，再用300μL流动相进行定容，样品中呕吐毒素的峰可与其他组分实现完全分离，不受其他组分峰型的干扰，且提高了方法的灵敏度。

2.2方法的线性范围与方法的检出限

在规定的色谱条件下，测定系列DON标准溶液，用峰面积对标准溶液中的质量浓度（100μg/L、300μg/L.500μg/L、1000pμg/L.2000pμg/L、4000μg/L、6000pμg/L）进行定量作图。DON标准溶液浓度从100μg/L递增到6000μg/L时，DON浓度和峰面积之间存在良好的线性关系，相关系数0.999 5。线性方程Y=71.023X+9.483 9（Y表示峰高；x表示DON含量，μg/L）。免疫亲和大体积进样的高效液相色谱法大大提高了检测灵敏度，采用逐级稀释法分析方法的检出限，根据信噪比为3的峰响应值，检出限为25μg/kg，信噪比为10的峰响应值为定量限，即60μg/kg。该方法完全可以满足检测国家标准对小麦及其制品中DON的最大限量要求。

2.3方法的回收率实验

取全麦粉、小麦粉和干面筋样品各1份空白样品，分别做200μg/kg、600μg/kg、1500μg/kg3个浓度水平的加标回收实验，每个浓度水平做8平行测定，结果见表1，回收率在74.7%～104.9%，RSD在6.4%～12.3%。

2.4样品的检测

随机扦取14份小麦样品，按照1.2操作制备相对应的全麦粉、小麦粉和干面筋各14份，按照前处理1.3和仪器条件1.4检测样品，检测结果见表2和图4。

3结论

（1）采用大体积进样、免疫亲和柱净化的高效液相色谱法检测小麦籽粒（全麦粉、小麦粉和干面筋）样品中，呕吐毒素方法的检出限25μg/kg，定量限60μg/kg，回收率在74.7%～104.9%，RSD在64%～12.3%。该方法简便快速、准确可靠、灵敏度高、重现性好，是检测小麦籽粒样品中呕吐毒素可靠有效的方法。

（2）试验结果显示，受呕吐毒素污染的小麦籽粒，不同部位污染程度有较大差异。呕吐毒素在小麦中含量分布很不均匀。麸皮中最高，小麦粉其次，干面筋中未检出呕吐毒素。全麦粉中呕吐毒素检出含量在608.1μg/kg～3356.5μg/kg；小麦粉中呕吐毒素检出的含量普遍较低，在62.7μg/kg～346.4μg/kg，嘔吐毒素含量降低了88.4%～95.3%，且均未超过卫生标准允许量（≤1000μg/kg）；小麦粉洗成干面筋后，未在干面筋中检出呕吐毒素。可见，全麦粉中呕吐毒素的含量是小麦粉中呕吐毒素的10倍，呕吐毒素污染主要集中在小麦的麸皮层中。