李建忠 张舸

【摘要】采用免疫亲和层析净化液相色谱法测定多种谷物（小麦、玉米和大米）样品中的赭曲霉毒素A。提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，采用高效液相色谱法荧光检测器测定，外标法定量。结果表明，不同粮食中赭曲霉毒素A在0.5～50.0ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（r）>0.999；样品在0.3μg/kg、5.0μg/kg和10.0μg/kg三个添加水平下的加回收率为84.4%～96.7%；方法检出限为0.3μg/kg，重复性的相对标准偏差为1.03%～3.17%。

【关键词】免疫亲和；层析净化；液相色谱法；赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素包括A、B、C、D四种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A（OTA）毒性最强、分布最广、对人类和动物影响最大，广泛分布于谷物、饲料及动物体内，对食品污染的范围广泛。毒理学研究表明，赭曲霉毒素A具有很强的肝脏毒性和肾脏毒性，并有致畸、致突变和致癌作用，许多国家对其制定了严格的限量标准，国际癌症研究机构将其定为2B类致癌物，所以控制谷物中OTA的含量至关重要。国家标准GB 2761规定谷物及其研磨加工品中OTA限量为5.0μg/kg。采用国标方法GB5009.96-2016中免疫亲和层析净化液相色谱法，通过加标实验测定阴性样品中OTA含量，采用的方法和所得数据为粮油质检部门提供参考。

1材料与方法

1.1材料

新收获玉米样品，经国标方法检测后确定为阴性样品。锤式旋风磨粉碎，85%过孔径为1mm试验筛，制备成玉米粉样品。

1.2主要仪器与试剂

LC-2010AHT液相色谱仪，配荧光检测器，日本岛津公司；HQBTWT93不锈钢均质器，北京中检维康生物技术有限公司；N-EVAPl2氮吹仪；CP512百分之一电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；OTA标准物质，浓度均为50.0μg/mL，有国家标准物质证书；甲醇、乙腈、冰乙酸：色谱纯；10倍PBS浓缩液；水为GB/T6682规定的一级水。

1.3高效液相色谱条件

荧光检测器；C18柱色谱柱150mm×4.6mm×5μm；检测波长：激发波长333nm，发射波长460nm；流动相：乙腈一水一冰乙酸（96+102+2、），流动相分别用抽滤器抽滤；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：50μL。

1.4试剂制备

标准工作液：标准品原液用流动相稀释成OTA浓度为500ng/mL，再用流动相分别稀释成OTA浓度为0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的标准工作液；提取液制备：80份甲醇加20份水；PBS缓冲液制备：PBS浓缩液用水稀释10倍。

1.5试样制备、提取、净化及检测

（1）精确称取样品25.0g，加入提取液100mL，高速均质2min后，槽纹滤纸过滤，准确取10mL滤液，用PBS缓冲液稀释至50mL，混匀后，经玻璃纤维滤纸过滤，收集滤液备用。样液不澄清再过滤一次。

（2）试样净化：连接OTA免疫亲和柱在玻璃注射器下，准确移取20mL滤液，置于其中。调节空气压力泵压力，以约1滴/s的流速使缓慢溶液通过免疫亲和柱，直至空气通过，依次以2滴/s的流速，用10mLPBS缓冲液、10mL水淋洗亲和柱，至空气通过，弃去流出液。

（3）洗脱：准确加入1.5mL甲醇洗脱液，以1滴/s的流速缓慢进行洗脱，用干净的离心管收集全部洗脱液，在45℃下氮气吹干，流动相复容到500μL，经有机相针式过滤器后，取50μL进样测定。同时做空白试验。

1.6标准曲线的制作

将标准工作溶液由低到高浓度依次取50μL进样测定重复4次，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标，得到标准曲线线性方程。

1.7加标回收率测定

按照GB/T27404-2008附录F的要求，回收率选择赭曲霉毒素A浓度为0.3μg/kg.5.0μg/kg、10.0μg/kg三个水平进行测定。实验分三组按照1.5的步骤进行测定，每组样品数为8份，加OTA标液浓度为500ng/mL。

1.8重复性测定

分别用浓度为0.5ng/mL、5.0ng/mL、20.0ng/mL的标准溶液，进行重复8次的测定，用测得的峰面积，分别计算相对标准偏差RSD值。

2结果与分析

（1）赭曲霉毒素A标准液线性方程及线性相关系数测定结果见表1，結果表明：该色谱条件下，赭曲霉毒素A出峰时间为7.56min，在0.5～50.0ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（r）>0.999，该方法的检出限为0.3μg/kg。

（2）加标回收率测定结果见表2，在0.3μg/kg水平下，回收率在84.4%～87.4%之间；在5.0μg/kg水平下，回收率在91.2%～96.7%之间；在10.0μg/kg水平下，回收率在97.4%～99.3%之间。结果表明：样品在0.3μg/kg.5.0μg/kg和10.0μg/kg三个添加水平下的加标回收率为84.4%～96.7%，符和GB/T 27404-2008附录F的规定。

（3）重复性测定结果见表3，结果表明：三个浓度下8次重复测定的相对标准偏差RSD值为1.03%～3.17%，浓度越高重复性越好。符合GB/T 27404-2008附录F的规定。

3结论

免疫亲和层析净化液相色谱法，操作简便、快速准确、回收率高、精密度良好、重现性好，适合谷物中赭曲霉毒素A的检测。