李利军，马英辉，卢美欢

（陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043）

高血压是目前威胁人类健康的主要疾病之一，治疗高血压的化学药物日益显现出较为明显的副作用。血管紧张素转化酶（angiotensin-convertingenzyme，ACE）是一种含锌二肽羧肽酶，可以调节血压，是引发人类患高血压的主要因素之一[1]。它能将无升压活性的血管紧张素I（angiotensin I，AngI）转化为具有强升压活性的血管紧张素II（angiotensin II，Ang II），同时会抑制有降压作用的缓激肽的分解，从而导致人体血压上升[2]。目前主要的ACE抑制药物有卡托普利、依那普利、赖诺普利等。但易引起干咳，偶见血管神经性水肿等许多不良反应[3-4]。近年来，食源性的ACE抑制肽受到普遍关注，一般由几个或几十个氨基酸组成。理论上讲，食物中的蛋白质水解后都可以产生多肽或低聚肽，包括含有ACE抑制活性的多肽，目前已有的报道主要来自于动物蛋白、植物蛋白和藻类蛋白等[5]。大豆蛋白是其中的重要原料之一。

1 微生物发酵法生产ACE抑制肽

与化学法相比，利用微生物发酵产生的ACE抑制肽具有成本低、无污染的优点，且所用菌种一般为可食用益生菌类，后期无需经过高度纯化也能食用，因而成为研究的热点。另外，微生物发酵法并不是单纯依靠微生物所产的蛋白酶将底物分解，产生目标产物，而是能够将酶解后释放的小肽再经过微生物的修饰、转移重组等作用，产生新的具有更优性质和更高应用价值的多肽[6]。

MAHTA M等[7]利用马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）发酵制备ACE抑制肽，获得了氨基酸序列为Val-Leu-Ser-Thr-Ser-Phe-Pro-Pro-Lys的片段，其半抑制活性可达15.2 μmol/L；陈应运等[8]以蛤蜊为原料，采用纳豆菌发酵制备ACE抑制肽，发酵产物对ACE抑制率达到80.49%；李风娟等[9]利用枯草芽孢杆菌发酵大豆，所产生的ACE半抑制率为0.312 mg/mL；李景[10]以豆粕为原料，利用米曲霉制备ACE抑制肽，抑制率可达到56.03%；李利军等[11]以大豆分离蛋白为原料，利用枯草芽孢杆菌BS90进行发酵，发酵40 h，ACE抑制率达81.8%；LI Y等[12]筛选出Kluyveromyces marxianusZ17菌株发酵牛乳，并采用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离纯化出2种ACE抑制肽，其半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分别为59.2 μg/mL、86.3 μg/mL。但是由于微生物发酵法的机理较复杂，反应进程不易控制，因此已有报道较少，多用于乳制品制备活性肽的研究中。而以蛋白为原料发酵的普通调味品中ACE活性抑制肽却不被大家所关注。

2 发酵调味品中的ACE抑制肽

发酵调味品是采用微生物发酵的方法，生产的具有食品调味和佐餐功能的一类食品。近年来，生物技术的发展突飞猛进，肠道益生菌的研究，给酵素带来巨大的市场空间。发酵调味品作为传统发酵食品，所含有的各种生物活性物质也得到广泛认可，其中ACE抑制肽成为关注热点之一。

发酵调味品主要有酱油、食醋、豆腐乳、黄豆酱、甜面酱、蚕豆酱、郫县豆瓣、豆豉等。其中酱油、豆腐乳、黄豆酱、豆豉均以黄豆为主要原料，经过微生物制曲、发酵产生氨基酸等鲜、香味物质而成。食醋、甜面酱分别以淀粉质原料为主，郫县豆瓣以蚕豆为主要原料，经微生物制曲发酵而成。事实上，即使制醋所用的原料以淀粉质为主，也仍含较高的蛋白质。如玉米、大米、高粱、小麦粉、蚕豆等，理论上说，均可产生ACE抑制肽，调味品主料及蛋白质含量见表1。

表1 部分酿造调味品所用主料及蛋白质含量Table 1 Main raw material and protein content for partial brewing condiments

2.1 发酵调味品中常用菌种

发酵调味品常用的微生物主要是能够产生蛋白酶的菌株，如米曲霉、毛霉、黑曲霉、酵母、枯草芽孢杆菌等。

米曲霉是发酵调味品中常用的生产菌，主要用于酱油、豆酱、豆豉等的酿造。李响等[13]研究了大豆分离蛋白作底物不同菌种的发酵作用，用肽含量和血管紧张素转化酶（ACE）抑制率为检测指标，分别对乳酸菌、霉菌和芽孢杆菌发酵后的产物进行ACE抑制活性测定，发现霉菌中具有较强ACE抑制活性的菌是米曲霉。其中曲霉菌分解大豆分离蛋白，使发酵液偏碱性，有利于大豆分离蛋白释放ACE抑制肽。

毛霉主要用于豆腐乳的生产。杭梅等[14]利用毛霉菌接种到豆腐上保温培养并发酵，采用乙醇为溶剂，进行提取，测定乙醇提取物的ACE抑制活性，发现到培养第5天时，活性最高。枯草芽孢菌主要用于细菌性豆豉发酵，也有发酵豆酱等，种类较多，纳豆菌也属其中之一。酵母一般用于后熟发酵，起辅助发酵产乙醇的作用，发酵后期产生乙醇、丁醇等有机醇类，可以与有机酸反应，生成有机酯类，是酱香风味物质的来源，但未见报道酵母菌产ACE抑制肽的研究。乳酸菌一般在酿造发酵食品中都有发现，属发酵过程自然伴生细菌，主要功能是完成乳酸发酵，产丰富的乳酸等有机酸，可以与醇类发生反应生成有机酯。万月[15]利用德氏乳杆菌发酵还原脱脂乳，ACE抑制率可达65.2%。

2.2 常见发酵调味品

2.2.1 豆酱

豆酱一般以大豆为原料，常见的发酵豆酱用菌种有米曲霉、枯草芽孢菌等。大豆经过浸泡蒸煮、晾凉，接入菌种进行通风保温制曲。然后加入食盐水进行保温发酵，制作而成。刘笑梅等[16]经发酵试验发现，豆酱制作过程中，发酵技术参数对ACE活性抑制率有影响：加水量为175%，保温50℃发酵12 d，效果最好。

刘婉璐等[17]研究了利用米曲霉为菌种，发酵制备豆酱时ACE抑制肽的活性变化情况，并分析了相关化学成分的变化，认为在发酵过程的前期，ACE抑制活性升高迅速，认为美拉德反应产物具有稳定后期样品高活性的作用。

2.2.2 酱油

酱油是我国传统调味食品。生产原料以大豆为主，菌种也多数采用米曲霉。一般经过原料处理、蒸熟变性、冷却晾凉后接种制曲，然后加拌曲盐水进行发酵。制作工艺主要有低盐固态发酵法、原池淋浇发酵法、低温稀醪发酵法。目前我国北方低盐固态发酵法依然有很多企业采用，然而也有很多企业为了提高产品风味，已经改为原池淋浇发酵法。我国南方大部分地区酱油生产都采用低温稀醪发酵法[18]。

日本的梅川逸人等[19]研究了日本溜酱油糟中的多肽对ACE的抑制及降压作用，认为日本的溜酱油多肽含量高于浓口酱油，是浓口酱油的2倍，采用透析、脱盐、冻干处理，精制后做成溜酱油糟多肽，ACE抑制作用明显较高，在大白鼠高血压模型（spontaneously hypertensive rat，SHR）的饲料中添加5 mg/kg就具有明显的降压效果。

李凤娟等[20]分析了7种酱油产品中ACE抑制肽的活性。认为大豆蛋白水解程度与ACE抑制活性并非呈正比，可能与多种化合物综合作用相关，有必要对其中的ACE抑制剂的结构特点进行更深入的分析。

2.2.3 豆豉

豆豉是中国传统食品，中医上淡豆豉入药。豆豉以整粒大豆为原料，经蒸煮、制曲、发酵而成。所用菌种各不相同风味各异：有米曲霉、毛霉，也有用枯草芽孢菌的。

虽然国内这方面的研究较少，但故意无视或选择性失明的现象却非常多。例如，在乡村学校中，老师有时会对调皮学生的一些行为故意无视，这种态度会使学生最终走上辍学的道路[15]。另外，在农民工受到不公平待遇时[16]，在报刊编辑工作中[17]，在企业管理中[18-19]，都存在故意无视或选择性失明的现象。旅游中也存在这样的问题。例如，后继旅游开发商无视前开发商与当地居民因利益冲突而退出当地的情况，仍然限制居民的参与权，忽视居民的“决策”“经营”“享益”的权利[20]。

苏现波等[21]对永川豆豉的理化指标、ACE抑制活性等指标进行了测定与评价，分别采用分光光度法和高效液相色谱法测定ACE抑制活性。结果显示，不同厂家生产的豆豉产品，其营养、感官及功能活性等指标均有不同，技术参数对豆豉相关品质的影响需要进一步研究。

2.2.4 豆腐乳

豆腐乳是中国传统发酵豆制品。在我国已有近千年的历史，因味美，具有佐餐、助消化功能而深受海内外华人欢迎。主要以大豆为原料，先制作为密度较大的豆腐，然后切小块再接种毛霉，待毛霉菌丝布满整个豆腐小块后，加盐水及辅料进行保温发酵。常见的有红方、白方、青方等。

加工工艺对豆腐乳中的ACE抑制活性影响较大。马艳莉等[22]研究了不同辅料和发酵参数对腐乳ACE抑制活性的影响，认为酒、红曲和面曲的添加对豆腐乳中的ACE抑制活性都有影响，乙醇使其在后酵第5周达最大；红曲作用在后酵第6周达最大；面曲的作用也是在后酵第6周达最大。总的来说ACE抑制活性在腐乳制作的后期发酵过程中，表现为先升后降趋势。

3 ACE抑制肽的分离纯化技术

ACE抑制肽都是混合多肽中的小组分物质，所以进行分离纯化是必不可少的环节。为了提高纯度，对多肽混合物目前常用的分离纯化方法主要有静态吸附法、超滤法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、高效毛细管电泳法、反相高效液相色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、质谱分析及氨基酸序列分析等方法。一般是先采用超滤处理，使不同分子质量的多肽混合物进行分离，再通过凝胶过滤色谱或者与离子交换色谱相结合达到进一步的分离，最后纯化技术采用反向高效液相色谱（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）、毛细管电泳。

陈合等[23]采用超滤法初步纯化，采用DA201-C型大孔吸附树脂脱盐，得到并富集具有ACE抑制活性的成分；钟芳等[24]运用RP-HPLC、大孔吸附树脂、凝胶过滤色谱法分离纯化ACE抑制肽，其ACE抑制率达到96.92%；邹基豪等[25]在绿豆中提取ACE抑制肽，用SephadexG-25凝胶柱色谱对酶解产物分离纯化，纯化后得到3个组分；刁静静等[26]采用模拟移动床（simulated moving bed，SMB）色谱技术产业化分离具有较高血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性的绿豆肽；毛跟年等[27]采用超滤、Sephadex G-25、Sephadex G-15及反相高效液相色谱对松仁清蛋白酶解液进行分离纯化，对纯化后样品（组分D2）进行质谱结构鉴定。质谱结果进行从头测序，筛选得到ACE抑制肽Tyr-Leu-Leu-Lys（YLLK），分子质量为535.34 Da。该肽经固相合成纯度为99.80%，其半数抑制浓度测定值为0.282 5 μmol/L；毛跟年等[28]利用碱性蛋白酶解魔芋蛋白，制备ACE抑制肽粗品；通过超滤法除去大分子杂质，再经过Sephadex G-15柱层析分离，最后经过RP-HPLC纯化，得到的魔芋ACE抑制肽纯度较高；张莹等[29]以猪皮水解液为原料，采用Sephadex G-15、半制备高效液相色谱分离纯化胶原ACE抑制肽，获得AP-I、AP-II两个组分，IC50值分别为19.50 mg/mL、1.01 mg/mL；李开等[30]采用超滤、离子交换色谱和反相高效液相色谱对薏苡仁谷蛋白中的ACE抑制肽进行分离纯化，最终获得组分B2在质量浓度0.01mg/mL时，ACE抑制率为（73.41±1.05）%；上海师范大学的杜梦珂[31]从富硒碱性茶蛋白中也获得了较高活性的ACE抑制肽。

另外，ACE抑制肽检测方法大都采用体外检测法，通过检测血管紧张素I的模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸（hippurlyhistidyl-leucine，HHL）的产物马尿酸的产量来反映ACE抑制肽的活性。目前，主要有紫外检测法、可见分光光度法和高效液相法。分光光度法由于操作步骤繁琐，导致结果误差较大。高效液相色谱能够准确的测定体系中马尿酸的产生量，是近年来测定ACE抑制肽的主要方法。

吴琼英等[32]用高效液相色谱法测定治疗高血压药物卡托普利（Captopril）对ACE的抑制效率，以马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）为反应底物，反应生成的马尿酸（hippuric acid，HA）为测定指标，利用直接进样和等度洗脱的方法进行测定，该法中等度洗脱可使马尿酸（HA）、组氨酰亮氨酸（histidyl-leucine，HL）、马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）良好分离，方便快捷。后又改进，利用高效液相色谱法测定ACE抑制肽的抑制率，更为简捷、精密、准确。

近年来高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）[34]发展迅猛，是传统电泳和现代微柱分离相结合的一种新型分离分析技术。具有时间短、分离效率高、检测限低、进样量小、溶剂消耗少、自动化程度高等优点，是高效液相色谱分析的补充。在蛋白质、氨基酸、有机化合物、药物分离分析等方面极为重要，特别是在活性肽纯度检验方面应用广泛。

4 酿造发酵调味食品的发展趋势展望

食源性的ACE抑制肽应是今后高血压防治研究领域关注的重点。目前我国ACE抑制肽的研究较多，但较为分散，不够系统，主要是在初级的制备、筛选、分离纯化方面，真正应用所形成的产品很少，偶有也是以功能食品的形式出现，难以实现产业化[35]。

发酵调味品是我国传统佐餐调味食品，原料富含蛋白质，选择优良的高产菌并优化制曲、发酵工艺和相关关键技术参数，提高发酵调味品中的ACE抑制肽含量，开发出高抑制活性的低盐腐乳、低盐豆酱、低盐酱油、低盐豆豉等产品，既可以满足群众日常生活中食品调味佐餐的消费需求，还具有调节虚血压的功能，使高血压患者或潜在高血压人群通过合理饮食就可以改善或调节血压，减少那些潜在的发病患者，是未来产业发展方向。

随着ACE抑制肽研究的不断深入，对发酵调味品中ACE抑制肽的研究，应关注：（1）提高产品中ACE抑制肽的含量，开发具有降压作用的酿造发酵调味食品；（2）采用计算机网络技术对制备条件进行模拟和优化，提高生成率；（3）研究ACE抑制肽构象与功能的关系，优化小分子ACE抑制肽的化学合成途径与技术；（4）构建基因工程菌，进行ACE抑制肽的大量表达；（5）开发具有ACE抑制肽功能的降压发酵调味食品。

其实中国传统的酿造发酵食品，历史悠久，对人体有重要的健康促进作用，通过ACE抑制肽的研究，发现并弘扬传统酿造产品的生理功能活性，带动传统产业升级换代具有重要意义。