范星菊，曲明星，谭磊，刘限

沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866

甜瓜（Cucumis melo）是重要的经济作物（王志丹等，2014）。然而，随着甜瓜种植年限延长，土壤质量逐渐恶化，如pH值降低、有机质含量减少、氮磷含量降低（徐小军等，2016）。甜瓜自毒物质在土壤中逐年积累，引起土壤酶活性和微生物种群结构改变（病原菌增多而有益菌减少）（周艳丽等，2015），从而导致土壤的生产力下降，连作障碍严重，甜瓜枯萎病普遍发生，导致甜瓜产量和品质下降，严重影响着瓜农的收入（Seo et al.，2017）。目前，甜瓜枯萎病的防治主要采用化学药剂防治，防治效果虽然较好，但容易造成土壤中致病菌的变异，从而增强致病菌对化学药剂的抗性，降低甜瓜的品质，同时也对环境造成很大的影响，威胁人类健康（唐琳等，2013；周小林等，2007）。因此，生物防治成为广大学者普遍探讨和追求的有机防治方法，其中木霉菌（Trichoderma sp.）是被广泛应用的生防菌，但其防治效果不稳定，易受环境因素的影响（陈捷等，2011；Gava et al.，2016）。目前关于甜瓜自毒物质（主要是阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸）对木霉菌生长的影响少见报道，同时也缺乏如何缓解这些自毒物质对木霉菌生长的研究。

生物炭是有机材料（木材、庄稼秸秆、有机废物等）在高温低氧条件下裂解形成的，具有较大的表面积、较高的pH值和较大电荷密度与表面负电荷等特点，同时具有较强的吸附能力（Lehmann et al.，2009）。其对土壤肥力的保持、田间持水量和阳离子交换量的提升等都有作用（陈红霞等，2011；Steiner et al.，2008）。另外，生物炭在提高作物产量和病害防治上也有一定的作用（Biederman et al.，2013；Zwart et al.，2012；Jaiswal et al.，2014；Elmer et al.，2011）。因此，研究甜瓜自毒物质对木霉菌生长的影响及生物炭对自毒物质毒害的缓解作用，明确自毒物质对木霉菌影响大小和木霉菌对自毒物质毒害作用的差异，探明生物炭缓解自毒物质对木霉菌毒害的作用效果，有助于提高木霉菌的生防效果，同时可为研制木霉菌多功能生防制剂提供理论支持，为甜瓜枯萎病的生物防治探索新的途径，促进甜瓜生产的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌种

本实验室分离所得的木霉菌菌株 T23、T33、TSY1、TSY2、TFC1、TFC2、TFC3、TFC4，其中T23和T33是实验室早期分离保留的木霉菌菌株，其余为2016年分离的不同地区的木霉菌菌株。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基：取新鲜土豆进行削皮去污，称量200 g土豆切片后放在蒸馏水水中煮沸，沸腾20 min左右在8层纱布下过滤，将过滤后的液体重新煮沸，并加入20 g葡萄糖和15～20 g琼脂糖，不断搅拌，待琼脂完全溶解，将溶液定容至1000 mL，用250 mL锥形瓶分装，于 121 ℃高压灭菌锅内灭菌 30 min后备用。

含3%生物炭的PDA培养基：每100 mL PDA培养基中加入3 g生物炭。

1.1.3 试剂

生物炭粉剂：来自于玉米秸秆，有效成分（质量分数）：8.83%有机碳、15.23%有机质、0.72%速效钾、0.0079%有效磷、0.0058%有效氮、61.1%灰分，pH=9.86，辽宁神农佰奥生物质科技开发有限公司生产。自毒物质：阿魏酸 FA（≥98%分析纯）、肉桂酸CA（≥99.5%分析纯）、苯甲酸BA（≥99.5%分析纯）均为国药集团化学试剂有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 不同种类以及浓度的自毒物质对木霉菌生长的影响

选取木霉菌菌株T23和TSY1，在含有不同浓度的 3种自毒物质阿魏酸（FA）、苯甲酸（BA）、肉桂酸（CA）（0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5 mmol∙L-1）的 PDA培养基进行培养，筛选出对木霉菌生长抑制作用明显的自毒物质浓度。在活化4 d 后的T23和TSY1木霉菌菌落边缘，用打孔器取直径为7 mm的菌片放入含有不同种类及浓度的自毒物质培养基平板中，每处理平板中央各放置1片，以不加自毒物质的PDA培养基为对照，每处理3个平行。于28 ℃培养箱中培养，第3天测菌落直径，得出抑制率。7 d后用10 mL无菌水水洗孢子，稀释后在血球计数板上计数，并计算自毒物质对产孢的抑制率。

式中，Rinh为自毒物质对产孢的抑制率；d0为对照处理木霉菌菌落直径（产孢量）；d为自毒物质处理木霉菌菌落直径（产孢量）。

1.2.2 生物炭缓解自毒物质对木霉菌生长、产孢的影响

于含自毒物质PDA培养基（CK）和同时加入3%生物炭的培养基（CB）上，分别培养活化后的菌株 TFC1、TFC2、TFC3、TFC4、TSY1、TSY2、T23和T33，每平板中央处放置1片菌片，每组3个重复，28 ℃培养箱中培养，第 3天测量菌落直径，7 d后用10 mL无菌水水洗孢子，稀释后在血球计数板上计数。

1.3 数据处理

运用SPSS和Excel软件分析处理数据，采用Duncan's新复极差法分析加入生物炭后自毒物质对木霉菌生长的影响。采用t检验分析生物炭缓解自毒物质对木霉菌生长和产孢的影响。

2 结果与分析

2.1 不同自毒物质对木霉菌生长的影响

木霉菌在含有不同浓度以及种类甜瓜自毒物质（阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸）中的 PDA培养基中培养，木霉菌的生长状态与培养形态均发生了变化，菌丝生长缓慢，菌落紧凑，都出现了生长受到抑制的现象，说明这些甜瓜自毒物质都能影响木霉菌的生长。选取木霉菌T23和TSY1研究自毒物质不同浓度对木霉菌生长的抑制作用，发现3种自毒物质在培养基中的浓度超过3 mmol∙L-1时，对2种木霉菌的生长有强烈的抑制作用，抑制率都超过50%（表1）。

研究3 mmol∙L-1阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸对不同木霉菌生长的影响，发现不同自毒物质对木霉菌生长有极显著的影响。总体而言，阿魏酸对各种木霉菌的生长影响较大，显著抑制了不同木霉菌的生长，苯甲酸抑制作用次之，肉桂酸抑制作用最小，但菌株TSY2的生长受肉桂酸影响较大，木霉菌菌落直径较小（表2）。自毒物质对不同木霉菌生长的抑制作用也存在极显著差异，阿魏酸对木霉菌菌株TFC2和TFC3的抑制作用较弱，而对菌株TFC1和T23的抑制作用强；苯甲酸对菌株TFC3和TSY1的抑制作用较弱，而对菌株 TFC1和 T23的抑制作用强；肉桂酸对菌株TFC2、TFC3和 TFC4的抑制作用较弱，而对菌株TSY1和TFC1的抑制作用强。由此可知，不同木霉菌对自毒物质的耐性（或抗性）是不同的，对3种自毒物质耐性（抗性）有较强的菌株有TSY2、TFC2、TFC3，较弱的有TFC1和T23（表2）。

2.2 自毒物质对木霉菌产孢的影响

除菌株FC3外，与对照相比，3种自毒物质（3mmol∙L-1）对木霉菌产孢的影响有极显著差异，处理后各种木霉菌的产孢量显著减少。总体而言，阿魏酸和苯甲酸对木霉菌产孢影响较大，而肉桂酸影响较小，但菌株 TSY2的产孢量受肉桂酸影响较大。自毒物质对不同木霉菌产孢的抑制作用也存在极显著差异，阿魏酸对木霉菌菌株TSY2和T33的抑制作用较弱，而对菌株TFC1、TFC54和T23的抑制作用强；苯甲酸能够促进菌株T23产孢，对菌株TFC3的抑制作用也较弱，而对菌株TFC2和TSY1的抑制作用强；肉桂酸对菌株TFC3产孢没有表现出抑制作用，对菌株TSY1的抑制作用强（表3）。由此可知，不同木霉菌产孢受自毒物质的影响不同，且不同自毒物质对不同木霉菌产孢的影响也存在差异。

表1 不同自毒物质不同浓度下对木霉菌生长的抑制作用Table 1 Growth inhibition effects of different autotoxic substances on Trichoderma at different concentrations

表2 3 mmol∙L-1不同自毒物质对木霉菌生长的影响Table 2 Effects of different autotoxic substances on Trichoderma growth at 3 mmol∙L-1

2.3 生物炭缓解自毒物质对木霉菌生长、产孢的影响

在含自毒物质的培养基中加入 3%生物炭后，木霉菌菌丝的生长速度和产孢量都发生了变化。含有生物炭的培养基上，木霉菌的生长速度显著增长，与不加生物炭相比，菌落直径极显著增大（图1）。大部分木霉菌菌株在加入生物炭后产孢量增加，缓解了自毒物质对木霉菌产孢的影响。生物炭能够缓解苯甲酸和肉桂酸对菌株 TFC1产孢的影响，显著增加产孢量；也能够缓解阿魏酸对菌株TFC2、TFC3、TSY1和T23产孢的影响，缓解肉桂酸对TFC4、TFC1和TSY1产孢的影响，缓解苯甲酸对T33和TFC1产孢的影响。但生物炭不能缓解肉桂酸对菌株TFC2和T33和阿魏酸对TSY2产孢的影响（图2）。

表3 3 mmol∙L-1不同自毒物质对木霉菌产孢的影响Table 3 Effects of different autotoxic substances on Trichoderma sporulation at 3 mmol∙L-1

3 讨论

植物自毒物质通过直接和间接作用影响土壤微生物的活动和种群结构，从而改变土壤环境，对自身和其他植物产生影响。研究发现，草莓（Fragaria ananassa）自毒物质阿魏酸和香豆酸对草莓炭疽病病原菌的生长表现出刺激作用（Tian et al.，2015），低浓度（50 mg∙L-1）酚酸（苯甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和苯丙酸）对黄瓜（Cucumis sativus）枯萎病病原菌菌丝生长有刺激作用（胡元森等，2007），西瓜（Citrullus lanatus）根分泌物能显著促进尖孢镰刀菌的生长（Hao et al.，2010）。这些研究结果均说明，自毒物质随着连作年限的增加而在土壤中逐渐积累，导致有害微生物增加。同时也有研究发现，松香酸的积累减少了辣椒（Capsicum frutescens）根际放线菌数量和微生物总量（周宝利等，2010）。飞机草（Chromolaena odorata）挥发油对真菌有明显的抑制作用，且抑制作用随挥发油浓度增加而增加（凌冰等，2003）。地黄（Rehmannia glutinosa）自毒物质抑制了有益微生物的生长，刺激了病原微生物的生长，从而造成地黄自毒物质的大量积累（杜家方等，2009）。本研究发现，不同自毒物质对生防木霉菌的生长都有抑制作用，且不同木霉菌对不同自毒物质的反应程度不同，说明不同木霉菌对自毒物质的耐性（或抗性）不同，可以根据生产实际选择耐性（或抗性）高的木霉菌菌株作为生防菌进行病害防治，从而提高甜瓜枯萎病的防治效果。有研究表明，这些自毒物质在某些情况下还可以作为微生物的碳源或能源，增强微生物的活性（袁光林等，1998），因此在生防菌筛选过程中可以作为筛选指标来筛选能够利用自毒物质的生防菌，从而降低土壤中自毒物质的含量，提高作物病害的防治效果。大部分木霉菌的产孢也受到了自毒物质的抑制作用，但有的木霉菌在自毒物质作用下的产孢量提高了，这说明自毒物质对不同木霉菌的作用效果不同，这也为生防木霉菌的筛选提供了筛选参考。

图1 生物炭缓解自毒物质对木霉菌生长的影响Fig. 1 Amelioration effects of biochar on Trichoderma growth with different autotoxic substances

图2 生物炭缓解自毒物质对木霉菌产孢的影响Fig. 2 Amelioration effects of biochar on Trichoderma sporulation with different autotoxic substances

自毒物质是作物连作障碍的主要原因，目前连作障碍的修复主要通过土壤生态修复技术来进行，主要包括农业措施、土壤有益微生物增殖技术和土壤有机养分缓释平衡技术，其中增施有机肥（菌肥）是被普遍采用的农艺措施（Zhao et al.，2014）。也有研究通过接入外源物质（如抗坏血酸）来缓解作物的自毒作用，提高植株的抗逆能力（马彦霞等，2015）。本研究发现，培养基中加入生物炭能有效缓解自毒物质对木霉菌生长和产孢的影响，说明生物炭在缓解自毒物质毒害作用上是一种非常有效的物质。生物炭进入土壤环境后，通过各种作用机制影响了微生物的生长代谢，还将改变微生物的生物地球化学功能，从而影响土壤环境中物质的迁移转化（张又弛等，2015）。生物炭通过其吸附作用、改善土壤理化性质和提高土壤微生物活性去除土壤中杀虫剂、除草剂等化学物质（或降低这些化学物质的生物活性）（Jablonowski et al.，2013；Zhang et al.，2018；Bielská et al.，2018）。Chen et al.（2012）也曾提出运用生物炭固定降解菌能够增强土壤中多环芳烃的生物降解效率，从而达到修复土壤生态环境，提高作物产量和品质的效果。由此可知生物炭在农业生产中的重要作用，在实际应用中可以选择生物炭作为木霉菌生防制剂的吸附剂，通过吸附作用降低自毒物质对木霉菌的影响，同时生物炭还可以为木霉菌等有益微生物提供庇护所（Samonin et al.，2004），有利于有益微生物的生存，保持木霉菌生防效果的持续性，从而达到对甜瓜枯萎病防治的长久性。

4 结论

甜瓜自毒物质对木霉菌生长和产孢都有一定的抑制作用（产孢上菌株TFC3除外），抑制效果表现为阿魏酸＞苯甲酸＞肉桂酸，在自毒物质浓度为0.1 mmol∙L-1时，抑制率超过 30%，在 3 mmol∙L-1时，抑制率超过50%。秸秆生物炭（质量分数为3%）能够缓解自毒物质对木霉菌生长和产孢的抑制作用，极显著地促进木霉菌的生长，第3天菌落直径基本与自毒物质培养基处理相当，但对产孢的缓解作用，不同自毒物质和不同木霉菌表现不同，有的表现为缓解作用，有的表现为抑制作用。