周宏胜，孙凤杰,2，罗淑芬，李鹏霞,3,*，颜廷才*

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；3.江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京 210014）

莲（Nelumo nucifera Gaertn.）为睡莲科多年生水生草本植物，是我国特有的植物，2012年全国种植面积达10亿 m2以上，主要集中在湖南、湖北、浙江、江苏等区域[1-2]。莲子含有多种营养保健成分，具有滋阴补脾、润肺养心等功效，尤其是鲜莲子，与干莲子相比更易食，且组织细腻、口感酥软、清甜可口，深受消费者喜爱[3]。然而，莲蓬采收季节多在高温季节，采摘后的莲蓬仍然是有生命的机体，呼吸作用及其他生理代谢都处于较高水平，耐贮性较差，在自然条件下极易发生褐变、衰老等品质劣变问题[4]。市场上新鲜莲子货架期一般在3～5 d[5]，其供应很难满足市场的需求，因此保鲜显得尤为重要。高建晓等[5]采用漆蜡处理莲蓬，在常温（25±1）℃条件下可抑制莲蓬褐变，延缓衰老；朱雁青等[6]采用具有特定透性的薄膜包装袋包装莲蓬，袋内O2、CO2体积分数分别维持在4.40%～13.03%和5.40%～8.10%范围，在（5±1）℃条件下延长了莲蓬的贮藏期，其他有关莲蓬保鲜技术的研究鲜见报道。

氯吡苯脲（1-(2-chloropyridin-4-yl)-3-phenylurea，CPPU）又名KT-30，是有细胞分裂素活性的苯脲类植物生长调节剂，也是目前人工合成的活性最高的细胞分裂素类物质，主要生理作用有：促进器官形成、蛋白质合成；延缓作物后期叶片衰老、增加产量；提高坐果率、诱导单性结实；延缓叶绿素降解，保绿护绿等[7]。CPPU常作为一种采前喷洒剂，应用于多种园艺作物上，用来增大果实、提高坐果率等。例如，李英等[8]研究显示，用CPPU处理瓠瓜子房可显著增加瓠瓜果实的早期产量和后期产量。Cruz-Castillo等[9]的研究表明，用低剂量CPPU喷洒猕猴桃藤蔓，果实质量增加约12%。近年来，CPPU作为植物生长调节物质已经延伸到了采后贮藏保鲜领域，例如，陈秋汝[10]用不同质量浓度的CPPU处理采后西兰花，发现CPPU质量浓度为12 mg/L时，西兰花在室温（15 ℃）及相对湿度79%条件下，其保鲜期可以延长4 d，并且叶绿素含量、可溶性蛋白质含量都表现为最佳。吴三林等[11]研究显示，经不同浓度的CPPU处理采后青花菜，感官品质和营养品质的下降均低于未处理的青花菜。张鲁斌等[12]用外源CPPU处理采后杧果，推迟杧果呼吸乙烯高峰出现，可以有效降低杧果果实在贮藏期间的病情指数。已有的研究证实CPPU在延缓采后果蔬衰老方面有一定效果，但目前研究报道还较少，特别是CPPU在鲜莲蓬及莲子保鲜方面鲜见报道。

因此，本实验以鲜莲蓬（‘太空莲36号’）为研究对象，首先以不同质量浓度CPPU对莲蓬进行浸泡处理，筛选适宜莲蓬保鲜的质量浓度；在此基础上，进一步研究CPPU处理对鲜莲蓬品质及活性氧代谢的影响，以期为鲜莲蓬采后保鲜研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验的莲蓬品种为‘太空莲36号’，于2016年7月28日采摘于江苏省淮安市金湖县荷盛莲业合作社，采后2 h内运回江苏省农业科学院农产品加工所果蔬保鲜与加工实验室。挑选大小均匀、无明显机械伤、无病虫害、成熟度一致的莲蓬作为实验材料。

氯吡苯脲、二氯甲烷（色谱级）、甲醇（色谱级）美国Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白 北京索莱宝科技有限公司；考马斯亮蓝G-250、氨基苯磺酸、1-萘胺、硫代巴比妥酸、盐酸羟胺、没食子酸、乙二胺四乙酸 上海瑞永生物科技有限公司；丙酮、硫酸钛、浓氨水、浓硫酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、氯化钠、无水硫酸镁、硫酸亚铁等 国药集团化学试剂有限公司；3,5-二硝基水杨酸 广东光华科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

7820A气相色谱仪 美国Agilent公司；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京谱析通用仪器公司；2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；3K15高速冷冻离心机 美国Sigma-Aldrich公司；A11 Basic液氮研磨器 艾卡（广州）仪器设备有限公司；CR-400全自动色差计 日本KONICA MINOLTA公司；A626544糖度计日本ATAGO公司；Seven multi pH计、PL202-L电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 适于莲蓬保鲜的CPPU质量浓度的筛选

用2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/L CPPU浸泡莲蓬5 min，以不作处理（CK0）和清水浸泡（CK1）作对照，每组处理3 个平行，每个平行10 个莲蓬。沥干后放在21 L带孔箱中，于（25±1）℃下放置7 d后去除莲房，对莲子拍照（照片图未列出），并测定莲皮色差、蛋白含量，确定适于莲蓬保鲜的CPPU合适质量浓度。

1.3.2 鲜莲蓬的CPPU处理

以5.0 mg/L CPPU对莲蓬进行处理，以不作处理（CK0）和清水浸泡（CK1）作对照。处理方法同上，每组处理96 个莲蓬，于（25±1）℃贮藏8 d。取样方法：贮藏期间每隔2 d取样，每组随机取莲蓬24 个，其中每个平行8 个，测定呼吸强度、色差后拍摄莲蓬、莲子照片，随机选取100 个莲子统计褐变个数，以不锈钢刀去除莲皮，切除莲子底部和顶端各约1 cm后去除莲子心，迅速将莲子置于液氮中，并最终存放在-80 ℃冰箱中，用于测定相关指标。

1.3.3 指标测定

1.3.3.1 色差的测定

用CR-400全自动色差计定期测量莲子L*、a*、b*值，仪器采用标准白板校正。其中，L*表示明度，a*和b*表示色度。每个处理测30 个莲子，取平均值。

1.3.3.2 可溶性蛋白含量的测定

可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法[13]。

1.3.3.3 褐变度的测定

参考Roig等[14]的方法略作改动。称取2 g莲子样品，加入10 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8）匀浆，4℃、10 000 r/min离心20 min。取上清液于410 nm波长处测定吸光度，按公式（1）计算褐变度。

1.3.3.4 可溶性固形物质量分数的测定

将莲子组织捣碎挤出汁液，滴到阿贝折光仪上测定，结果以%表示。测定重复6 次取平均值。

1.3.3.5 淀粉含量的测定

淀粉含量测定参考何其芳等[15]的方法。

1.3.3.6 呼吸强度的测定

参考高建晓等[16]的方法，贮藏期间每2 d取气测定。随机选取8 个莲蓬称质量后置于21 L气调保鲜箱中，每个处理设置3 个重复，于（25±1）℃条件下密闭1 h后用注射器取样气，抽取15 mL样气，用气相色谱测定。色谱条件：Porapak Q 80/100 SS色谱填充柱；氢火焰离子化检测器，柱温70 ℃，N2压力0.5 MPa，H2压力0.3 MPa，空气压力0.5 MPa，重复3 次，外标法定量。

1.3.3.7 H2O2含量的测定

参照王友升等[17]的方法略作改动。取2 g莲子样品加入预冷丙酮8 mL，浸提1 h，4 ℃、10 000 r/min离心20 min，得上清液。取1 mL上清液加入0.1 mL 质量分数10%硫酸钛、0.2 mL体积分数25%浓氨水，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，沉淀加入10 mL丙酮振荡清洗后离心，得到沉淀再加入3 mL 2 mol/L H2SO4溶解，于415 nm波长处测定吸光度。H2O2含量以每克鲜样的H2O2物质的量表示（μmol/g）。测定重复3 次。

1.3.3.8 O2-•生成速率的测定

参照Ren Yalin等[18]的方法略有改动。取2 g样品，加入8 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸盐缓冲液，4 ℃、10 000 r/min离心20 min。取1 mL上清液加入1 mL磷酸盐缓冲液和1 mL 1 mmol/L盐酸羟胺，25 ℃保温1 h后，依次加入1 mL 17 mmol/L对氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol/L 1-萘胺，25 ℃反应20 min，测定波长530 nm处的吸光度。用磷酸盐缓冲液作空白，O2-•生成速率单位表示为μmol/（min·g）。测定重复3 次。

1.3.3.9 丙二醛含量的测定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸比色法[19]略改动：称取2 g莲子样品，加入体积分数5%三氯乙酸8 mL（V），漩涡振荡均匀，放置浸提1 h。4 ℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液2 mL（V2），加入2 mL质量分数0.67%硫代巴比妥酸，混合后水浴煮沸30 min，冷却后4 ℃、10 000 r/min离心20 min，分别于450、532、600 nm波长处测定吸光度，按公式（2）计算MDA含量。重复测定3 次。

式中：V1为反应液总体积/mL；V2为反应液中的加入的提取液体积/mL；V为提取液总体积/mL；m为样品质量/g。

1.3.3.10 超氧化物歧化酶活力的测定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的测定采用氮蓝四唑法[20]。取2 g莲子样品，加入0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）8 mL，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，上清液即为粗提液。以每分钟每克样品的反应体系对氮蓝四唑光还原的抑制50%为一个SOD活力，单位为U/g。重复测定3 次。

1.3.3.11 过氧化氢酶活力的测定

过氧化氢酶（catalase，CAT）活力的测定参考Han Junhua等[21]的方法略有改动。粗酶液制备同SOD测定中粗酶液制备方法。取0.05 mL粗酶液和2 mL 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）在25 ℃水浴下预热5 min，加入1 mL体积分数0.2% H2O2，立即于240 nm波长处测定吸光度，以1 min内吸光度减少0.1为一个酶活力单位，以U/g表示CAT活力的单位。

1.3.3.12 过氧化物酶活力的测定

过氧化物酶（peroxidase，POD）活力的测定参考Qian Chunlu等[22]的方法略有改动。粗酶液制备同SOD测定中粗酶提取方法。取0.2 mL粗酶提取液加入2 mL 0.05 mol/L愈创木酚，在30 ℃水浴中平衡5 min，然后加入1 mL体积分数0.2% H2O2，混匀，1 min后于470 nm波长处测定吸光度，以1 min内吸光度减少0.01为一个酶活力，单位为U/g。测定重复3 次。

1.3.3.13 多酚氧化酶活力的测定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的测定参考Wang Jun等[23]的方法略有改动。取2 g莲子样品，加入0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）10 mL，10 000 r/min、4 ℃离心20 min。将0.1 mol/L的邻苯二酚溶液在30 ℃保温，取该溶液3 mL，迅速加入粗酶提取液0.5 mL，反应温度为30 ℃，5 s后于398 nm波长处测定吸光度，以1 min内吸光度上升0.01为一个酶活力，单位为U/g。

1.3.3.14 CPPU含量的测定

参考侯玉茹等[24]的方法略有改动。

样品前处理：称取3 g样品匀浆，置于离心管中，加入乙腈15 mL，漩涡振荡2 min，超声提取20 min，过滤后加入含有4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠的离心管中，漩涡振荡2 min，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，静置10 min，取上层提取液，氮吹浓缩至干。

浓缩样品经二氯甲烷溶解，碱性Al-N柱净化，5 mL二氯甲烷淋洗，甲醇洗脱，收集洗脱液15 mL，氮吹浓缩至干，1 mL甲醇溶解，过0.45 μm滤膜，采用高效液相色谱仪测定。色谱条件：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：40 ℃；紫外检测波长：260 nm；流动相：V（甲醇）∶V（纯水）＝63∶37；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL。

1.4 数据处理

所有数据均平行测定3 次，数据采用平均值±标准差表示，所有数据用SPSS 20.0软件进行分析，显著性采用ANOVA进行邓肯氏多重差异分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 适于莲蓬保鲜的CPPU质量浓度的筛选结果

由拍照的图（未列出）可看出，莲蓬在贮藏到第7天时，莲房和莲子均有不同程度的褐变。20.0 mg/L CPPU处理组与CK0、CK1组无明显差异，其他质量浓度处理均能不同程度减缓莲蓬褐变。其中5.0 mg/L和10.0 mg/L CPPU处理效果最好，保持了莲蓬和莲子较好的表型，维持了商品性。

图 1 不同方式处理对莲皮色差（A）和莲子蛋白含量（B）的影响Fig. 1 Effect of CPPU treatment at different concentrations on color difference of lotus seed coats (A) and protein content of lotus seeds (B)

L*值越大表示所测样品的表面越明亮；a*值正值为红色，负值为绿色，绝对值越大表示红色或绿色越深；b*值正值为黄色，负值为蓝色，绝对值越大表示黄色或蓝色越深。由图1A可见，贮藏至第7天时，与其他处理组相比，5.0 mg/L和10.0 mg/L CPPU处理组的a*值小，L*值最高，b*值低，说明5.0 mg/L和10.0 mg/L CPPU处理使莲皮呈现亮绿色，黄褐色程度小，能更好地保持莲皮颜色。从图1B可以看出，贮藏到第7天时，5.0 mg/L和10.0 mg/L处理组莲子蛋白含量显著高于其他处理组（P＜0.05）。综合筛选实验结果，5.0 mg/L和10.0 mg/L CPPU作用效果最好，不仅较好保持莲蓬外形和色泽，而且能保持莲子较高的蛋白质含量，考虑到经济和残留问题，选择低质量浓度的5.0 mg/L进行CPPU保鲜效果研究。

2.2 CPPU处理对鲜莲蓬和莲子品质及莲子褐变度的影响

由所拍照片（未列出）可知，在贮藏期间莲蓬和莲子均发生不同程度的褐变。在4 d时，所有处理组莲房无明显变化，但CK0、CK1莲皮变为颜色较淡的黄绿色；到6 d时，CK0和CK1莲房出现轻微褐变，而莲子已出现明显褐变，均约有80%的莲子发生褐变，而CPPU处理的莲子和莲房仍能维持较好的表型；到8 d时，CK0和CK1组莲房出现面积较大的褐变，边缘褐变尤为严重，莲子颜色进一步加深，由6 d时的黄褐色变为深褐色，彻底失去商品价值，而CPPU处理的莲房略有褐变，莲子虽个别颜色偏黄，但整体上保持了较好的表型。

图 2 CPPU处理对莲子褐变度的影响Fig. 2 Effect of CPPU treatment on browning degree of lotus seeds

由图2可以看出，贮藏期莲子褐变度呈上升趋势，0～2 d，莲子褐变度变化较小，CK0、CK1组从第2天开始急剧上升，第8天时分别是CPPU处理组的3.01、2.91 倍，而5.0 mg/L CPPU处理组在整个贮藏期一直保持较低的水平，显著低于CK0、CK1组（P＜0.05），这表明5.0 mg/L CPPU处理可有效延缓莲子褐变。

2.3 CPPU处理对莲子可溶性固形物质量分数和淀粉含量的影响

图 3 CPPU处理对莲子可溶性固形物质量分数（A）和淀粉含量（B）的影响Fig. 3 Effect of CPPU treatment on TSS content（A）and starch content（B）of lotus seeds

由图3A可知，采后莲子可溶性固形物质量分数在贮藏期整体有所增加，在第0～2天略有下降，之后开始上升，至第6天时，CK0、CK1组开始下降，而5.0 mg/L CPPU处理组仍呈现上升趋势，且5.0 mg/L CPPU处理组在整个贮藏期显著低于CK0、CK1组（P＜0.05），这说明5.0 mg/L CPPU处理能抑制可溶性固形物的累积。

由图3B可知，采后莲子淀粉含量呈先上升后下降的趋势，CK0、CK1组在2 d后开始急剧下降，而5.0 mg/L CPPU处理组淀粉含量在0～6 d不断累积，从第6天开始下降，贮藏期4～8 d之内显著高于CK0、CK1组（P＜0.05），说明5.0 mg/L CPPU处理可有效维持莲子内部较高的淀粉含量。

2.4 CPPU处理对莲子呼吸强度的影响

图 4 CPPU处理对莲子呼吸强度的影响Fig. 4 Effect of CPPU treatment on respiration rate of lotus pods

由图4可知，在整个贮藏期间，莲蓬呼吸强度整体呈现下降的趋势，无明显的呼吸高峰出现。5.0 mg/L CPPU

处理组呼吸强度保持较低的水平，并在第4天及第8天显著低于CK0、CK1组（P＜0.05），说明5.0 mg/L CPPU处理有助于降低鲜莲蓬的呼吸速率。

2.5 CPPU处理对莲子H2O2含量、O-2•生成速率和MDA含量的影响

图 5 CPPU处理对莲子H2O2含量（A）、•生成速率（B）和MDA含量（C）的影响Fig. 5 Effect of CPPU treatment on of H2O2 content (A), the rate of generation (B) and MDA content (C) in lotus seeds

当H2O2大量积累时，会破坏植物体内自由基清除系统，从而影响植物体正常生理代谢，导致果实衰老。由图5A可以看出，0～2 d，两对照组H2O2含量上升迅速。而5.0 mg/L CPPU组在0～4 d含量相对平稳，虽然在4 d后H2O2含量开始较快上升，但仍小于CK0和CK1组，且在整个贮藏期间显著低于两对照组（P＜0.05）。

MDA是膜脂过氧化产物之一，其含量的增加是膜结构损伤的重要标志。由5C可以看出，在贮藏期间MDA含量整体呈上升趋势，在贮藏后期（6～8 d），CK0、CK1组MDA含量显著高于5.0 mg/L CPPU处理组（P＜0.05），特别是第6天，CK0、CK1组MDA含量分别达到1.64、1.97 μmol/g，分别是5.0 mg/L CPPU处理组1.12 μmol/g的1.46、1.76 倍。

2.6 CPPU处理对莲子相关酶活力的影响

图 6 CPPU处理对莲子SOD（A）、CAT（B）、POD（C）和PPO（D）活力的影响Fig. 6 Effect of CPPU treatment on SOD (A), CAT (B), POD (C), and PPO (D) activities in lotus seeds

由图6A可以看出，在贮藏前2 d，莲子SOD活力急速下降，之后呈上升趋势，到第6天时又下降，但是在整个贮藏期，5.0 mg/L CPPU处理组SOD活力始终高于两对照组，且在第8天呈显著差异（P＜0.05）。由图6B可知，在整个贮藏期，5.0 mg/L CPPU处理组莲子的CAT活力变化相对平缓且始终高于对照组，特别是第8天分别达到了CK0、CK1组的2.50、1.39 倍。由图6C可知，贮藏期间POD活力呈上升趋势，CK0、CK1组分别在第2、4天开始急剧上升，而5.0 mg/L CPPU组上升相对平稳，至贮藏6～8 d时显著低于CK0与CK1组（P＜0.05）。由图6D可见，莲子PPO活力呈现先上升后下降的趋势，在贮藏期间，5.0 mg/L CPPU处理组始终低于CK0和CK1组，且在第2～4天达到显著差异（P＜0.05）。

2.7 莲子中CPPU残留含量

表 1 莲子中CPPU残留含量Table 1 CPPU residue levels in CPPU-treated lotus seeds

由表1可以看出，CK0、CK1组均未检出CPPU，而CPPU处理组仅在2、4 d和6 d有CPPU检出，且随时间延长呈现下降趋势。参照GB 2763—2014《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[25]中CPPU在果蔬中最大残留量为0.1 mg/kg，本研究莲子中CPPU残留含量明显低于国家标准规定的残留限量。

3 讨 论

果蔬采后衰老是一系列复杂的生理变化，而呼吸作用的强弱是果蔬采后衰老快慢的重要信号之一，鲜莲蓬在采后仍能保持较高呼吸强度，这是造成鲜莲蓬保鲜期极短的重要原因[26]。CPPU作为一种植物生长调节剂在果实膨大过程中起着重要的作用，但鲜见CPPU采后处理造成果蔬膨大的报道。已有研究发现CPPU对某些品种果蔬采后品质的维持及呼吸的抑制具有较好的作用，可延缓果蔬的衰老和叶绿素的降解，例如，黄华等[27]发现CPPU处理可明显抑制采后香蕉呼吸强度，并显著抑制果皮褐化，延缓果实衰老。本实验也得出，CPPU处理能显著抑制莲蓬呼吸作用，减缓莲房及莲子褐变，保持莲子蛋白含量，这与王云莉等[28]对青花菜的研究结果相似；此外，CPPU处理有效抑制了可溶性固形物质量分数的增加，这可能是由于可溶性糖主要来源于淀粉的降解，CPPU抑制了莲子淀粉的降解，维持较高的淀粉含量，因此保持较低的可溶性固形物水平[29]。

自由基学说研究认为生物体衰老过程是活性氧代谢失调与累积的过程[30]。活性氧是细胞内有氧代谢过程中产生的具有很高生物活性的含氧化合物的总称，主要包括O2-•、H2O2等，当植物衰老时，细胞内活性氧产生和清除的动态平衡被打破，活性氧大量积累，诱发膜脂过氧化，加速膜脂过氧化产物MDA含量增加和细胞膜结构破坏，从而加快植物组织衰老或死亡[31-32]。植物体中的防御酶系统可以清除植物体内的活性氧，主要有SOD、CAT、POD等，SOD消除O2-•产生H2O2，而H2O2可被CAT分解[33]。本研究发现与对照组相比，CPPU可以维持莲子较高的SOD和CAT活力，即提高了清除莲子组织ROS的能力，这与CPPU在菜心[34]上的作用一致；由此，使莲子H2O2和O2-•含量保持较低的水平，这说明CPPU处理使莲子组织膜脂化程度降低，从而减少了MDA的产生，保持了膜完整性，抑制了莲子的衰老。郭叶等[35]的研究也发现CPPU处理能较好地保持猕猴桃果实细胞壁及膜的完整性，减缓膜结构的氧化作用。

通过贮藏期间的观察，本实验发现，莲子衰老过程中最显著的变化是莲皮失绿和莲子褐变，这也是影响其商品性的关键特征。POD虽然作为保护酶参与清除自由基，但POD在氧存在下能催化酚类、类黄酮的氧化和聚合，导致组织褐变[36]。本研究发现CPPU处理能有效降低莲子褐变度，这可能由于CPPU处理有效抑制了莲子POD活力上升，由此减缓了莲子组织酚类物质氧化，与Li Pengxia等[37]的研究类似。另外，前人的研究也发现，CPPU处理蚕豆离体叶片能有效抑制其组织内POD活力升高，并延缓叶绿素a和叶绿素b的降解，从而延缓蚕豆离体叶片的衰老[38]。莲子褐变与PPO活力密切相关[5]，在贮藏期，莲子PPO活力整体呈上升趋势，CPPU处理能有效抑制PPO活力的升高，从而达到抑制莲子褐变的作用。

综上所述，CPPU处理可维持采后莲蓬的感官品质及较低的呼吸强度，维持较高SOD、CAT等抗氧化酶活力，减少活性氧的产生，从而减少MDA积累，避免了膜脂过氧化的伤害，同时通过抑制POD、PPO活力的升高来减缓组织褐变，进而达到延缓莲蓬及莲子衰老的目的。