高帅平，李顺峰,*，李 静，王安建

（1.河南省农业科学院农副产品加工研究中心，河南 郑州 450002；2.桂林理工大学化学与生物工程学院，广西 桂林 541004）

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是世界上栽培最广、产量最大的食用菌[1]。双孢蘑菇富含蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质、膳食纤维、多酚和黄酮等营养活性物质，具有较好的营养作用和保健功能，且味道鲜美，深受消费者喜爱[2-3]。然而双孢蘑菇菇盖表面无保护结构，且含水量高，呼吸旺盛，极易发生褐变、衰老、失水、微生物侵染等品质劣变现象，常温下其货架期不超过3 d[4-5]。研究表明，酶促褐变和活性氧（reactive oxygen species，ROS）引起的氧化损伤是影响双孢蘑菇采后品质的重要因素[5-6]。低温冷藏、气调贮藏、射线辐射处理和化学保鲜是保持双孢菇品质的主要方法，但却存在着保鲜效果差、成本高及安全性低等问题[7-10]。随着社会发展和人们生活水平的不断提高，对食品安全和品质要求越来越高，寻找安全环保的保鲜剂受到广泛关注。

植物乳杆菌（Latobacillus plantarum）是乳酸菌的一种，与其他种类其他乳酸菌相比，该菌的活菌数较高，除能产生大量调节pH值和降解重金属的有机酸，还能产生细菌素、H2O2、双乙酰等抗菌物质，可作为生物防腐剂抑制病原微生物的生长[11-14]。目前，植物乳杆菌及其代谢产物多应用在肉制品、水产品、奶制品以及发酵制品等食品工业中，而在新鲜果蔬贮藏保鲜方面的研究较少。Martínez-Castellanos等[15]研究发现植物乳杆菌能够降低荔枝果皮的微生物含量，同时保持花色苷含量和降低果皮褐变程度。植物乳杆菌产生的乳酸能够酸化红毛丹果实的果皮和抑制褐变，植物乳杆菌处理还能保持其果皮的色泽和降低水分的损失[16]。这说明植物乳杆菌不仅能减轻果蔬的褐变与腐烂，还能保持果蔬的营养品质和减少水分的损失。

本实验通过研究植物乳杆菌发酵液处理对双孢蘑菇冷藏过程中颜色、总酚含量、褐变相关酶活力、ROS含量及抗氧化酶活力等方面的影响，揭示植物乳杆菌对双孢蘑菇的保鲜作用及机理，进而为开发新型、绿色双孢蘑菇保鲜剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）采自洛阳奥达特食用菌技术开发有限公司，采收后分层放入贮运保鲜箱预冷后立即运回实验室进行处理，选取大小和成熟度一致、颜色洁白、无开伞、无病虫害和机械损伤的双孢蘑菇进行实验。

植物乳杆菌（Latobacillus plantarum）GIM1.191广东省微生物菌种保藏中心；所有检测用化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Color Flex EZ色差仪 美国Hunterlab公司；TMSPro质构仪 美国Food Technology公司；LHS-250HC-Ⅱ恒温恒湿箱 上海一恒科学仪器有限公司；Revco ExF24086V超低温冰箱 美国Thermo公司；FA2004C分析天平 上海越平科学仪器有限公司；UV1800紫外分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；H2050R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

常温（20±1）℃条件下，将双孢蘑菇在体积分数2%植物乳杆菌接种发酵液（37 ℃培养16 h）10 倍稀释液中浸泡处理5 min，取出后沥干水分，放置于塑料筐内且表面用聚乙烯保鲜膜（氧气透过率（14 200.00±0.40）cm3/（m2·d·atm）、二氧化碳透过率（65 000.00±0.20）cm3/（m2·d·atm）、透湿量（68.00±0.20）g/（m2·d））包裹后在4 ℃、相对湿度85%条件下贮藏，以清水处理的双孢蘑菇为对照。每隔3 d取样1 次，进行颜色评价后，用液氮将鲜样冻干粉碎后贮藏于—80 ℃冰箱备用。

1.3.2 色泽评价

用ColorFlex EZ色差仪测定双孢蘑菇菇盖的CIE L*（白/黑）值，仪器用标准白板（L*＝94.11）校正，每个处理组测定10 个整菇，用L*值表示颜色变化，L*值越高表示褐变程度越轻，品质越好。

1.3.3 总酚含量的测定

总酚含量采用福林-酚法测定，用没食子酸当量（mg/g）表示，结果以鲜质量计[2]。

1.3.4 PPO、PAL活力的测定

取双孢蘑菇冻干粉1.0 g，加入50 mmol/L pH 7.8磷酸盐缓冲液（含0.8 g/L聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）和1 mmol/L EDTA）5 mL，冰浴提取10 min，10 000 r/min离心15 min（4 ℃），上清液即为粗酶液，参照Gao Mengsha等[2]的方法测定多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）的活力，以1 min内OD值减少0.01所需的酶量为一个酶活力单位（U），酶活力以U/mg pro表示。蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[17]，以牛血清白蛋白做标准曲线。

1.3.5 H2O2含量、抗O2-·活力的测定

取双孢蘑菇冻干粉1.0 g，加入预冷的丙酮，冰浴提取10 min，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，上清液即为样品提取液[18]。H2O2含量、抗·活力采用相应试剂盒进行测定。

1.3.6 POD、CAT活力的测定

取双孢蘑菇冻干粉样品1.0 g，加入50 mmol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液5 mL，冰浴提取10 min，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，上清液即为粗酶液，参照Aebi[19]的方法测定过氧化物酶（peroxidase，POD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）的活力。蛋白质含量的测定同1.3.4节。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌发酵液对双孢蘑菇颜色的影响

颜色是评价双孢蘑菇的重要指标之一，也是影响消费者对双孢蘑菇接受程度的关键因素[20]。本实验采用L*值来反映双孢蘑菇颜色的变化，L*值越大，表示其表面亮度越高，褐变程度越低，品质越好[21]。如图1所示，随着贮藏时间的延长，L*值先逐渐下降之后出现平稳波动；在贮藏前期（0～6 d），对照组的L*值迅速下降，而处理组下降较缓慢；在整个贮藏过程中，处理组的L*值均高于对照组。表明植物乳杆菌发酵液处理可以减轻双孢蘑菇的褐变程度，保持较好的颜色。

图 1 植物乳杆菌发酵液对双孢蘑菇L*值的影响Fig. 1 Effect of Latobacillus plantarum-fermented liquid on L* value of Agaricus bisporus

2.2 植物乳杆菌发酵液对双孢蘑菇总酚含量的影响

酚类物质是双孢蘑菇发生酶促褐变的重要底物[22]。当菇体受到伤害或自然老化时，在PPO的作用下，酚类物质被催化氧化为醌类物质，并进一步聚合形成粉色、褐色化合物，导致菇体褐变，从而影响其商品价值[7,23]。如图2所示，对照组双孢蘑菇的总酚含量在贮藏前期和贮藏后期均呈现先上升后下降趋势，并分别于6 d和12 d出现大小峰值；与对照组相比，植物乳杆菌发酵液处理的双孢蘑菇总酚含量均低于对照组，且在6 d时，其总酚含量为0.730 mg/g，比对照组低29.47%。表明植物乳杆菌发酵液处理可以有效减轻双孢蘑菇内总酚含量的积累，防止其褐变程度不断加深。

图 2 植物乳杆菌发酵液对双孢蘑菇总酚含量的影响Fig. 2 Effect of the fermentation broth on total phenol content of Agaricus bisporus

2.3 植物乳杆菌发酵液对双孢蘑菇PPO、PAL活力的影响

双孢蘑菇组织中的PPO催化酚类物质氧化为醌，进而产生黑色素，是双孢蘑菇贮藏过程中发生褐变的主要原因[23]。如图3a所示，对照组双孢蘑菇体内的PPO活力在贮藏前期保持稳定，之后逐渐升高，6 d时达到最大值后再缓慢下降；植物乳杆菌发酵液处理的双孢菇PPO活力在整个贮藏期间内显著低于对照组（P＜0.05），贮藏6 d时的PPO活力为8.85 U/mg pro，比对照组低36.33%。表明植物乳杆菌处理可以有效降低双孢蘑菇组织中的PPO活力，抑制褐变的产生。

图 3 植物乳杆菌发酵液处理对双孢蘑菇PPO（a）、PAL（b）活力的影响Fig. 3 Effect of the fermentation broth on PPO (a) and PAL (b)activities of Agaricus biaporus

PAL是次生代谢关键酶，对果蔬采后保鲜有着重要影响。有研究表明，当植物受到病原菌侵染后，PAL活力被激发，迅速生成与抗病有关的植物保卫素、生物碱等生化物质，进而有效抑制病原菌的扩展，因此PAL活力可作为植物抗病性的重要指标[24]。由图3b可知，对照组双孢蘑菇PAL活力在贮藏期间呈先上升后下降趋势，在9 d时达到最大值。植物乳杆菌处理的双孢蘑菇PAL活力在贮藏前期与对照组无显著差异（P＞0.05），贮藏6 d后，其活力均高于对照组，贮藏9 d时PAL活力为0.21 U/mg pro，显著高于对照组19%（P＜0.05）。这表明，植物乳杆菌处理可以提高贮藏后期PAL活力，从而增强双孢蘑菇的抗病性。

2.4 植物乳杆菌发酵液对双孢蘑菇H2O2含量和抗·活力的影响

ROS被认为是果蔬采后代谢过程中的毒副产品，能引起大分子物质如脂类、蛋白质及DNA的损伤[25]。H2O2和·均是重要的ROS，其含量越高，对组织细胞的毒害作用越大。由图4a可知，对照组双孢蘑菇体内的H2O2含量先缓慢上升然后保持基本稳定，之后迅速上升，在12 d时达到最大值，然后下降至贮藏结束。在整个贮藏期内，植物乳杆菌发酵液处理组双孢蘑菇体内的H2O2含量均低于对照组，并在3 d和12 d时呈显著差异（P＜0.05）。抗·活力表示机体抑制·的能力，从图4b可以看出，贮藏前期（0～6 d），对照组双孢蘑菇抗·活力先略微升高再逐渐下降，贮藏后期，其呈先上升后下降的趋势，并在12 d时达到最大值。在整个贮藏期内，除了6 d时，两组双孢蘑菇抗·活力保持一致外，其他贮藏时间的植物乳杆菌发酵液处理组双孢蘑菇抗·活力均高于对照组，且在贮藏后期（9～12 d）呈显著差异（P＜0.05）。以上结果表明，植物乳杆菌发酵液处理可以降低双孢蘑菇H2O2含量，同时提高其抗·活力，从而减轻ROS对双孢蘑菇的毒害作用。

图 4 植物乳杆菌发酵液处理对双孢蘑菇H2O2含量（a）和抗·活力（b）的影响Fig. 4 Effect of the fermentation broth on H2O2 content (a) and antisuperoxide anion radical activity (b) of Agaricus biaporus

2.5 植物乳杆菌发酵液对双孢蘑菇POD、CAT活力的影响

图 5 植物乳杆菌发酵液处理对双孢蘑菇POD（a）、CAT（b）活力的影响Fig. 5 Effect of the fermentation broth on POD (a) and CAT (b)activities of Agaricus biaporus

POD与植物组织抗性有关，其活力越高，抗逆作用越强；CAT是清除果蔬组织内部H2O2的主要酶类，对组织细胞具有保护作用[26]。以上两种酶均属于抗氧化系统酶类。由图5a可知，双孢蘑菇POD活力随着贮藏时间的延长，呈现先上升后下降再保持稳定的趋势，整个贮藏期内，植物乳杆菌发酵液处理组双孢蘑菇POD活力均显著高于对照组（P＜0.05）。双孢蘑菇CAT活力如图5b所示，贮藏前期（0～3 d），对照组CAT活力显著下降，而处理组则略微上升；随着贮藏时间的延长，对照组和植物乳杆菌发酵液处理组双孢蘑菇CAT活力均呈先上升后下降趋势，分别于9 d和6 d达到最大值；贮藏后期（12～15 d），两组双孢蘑菇CAT活力均缓慢上升。在整个贮藏期内，植物乳杆菌发酵液处理组双孢蘑菇CAT活力均显著高于对照组（P＜0.05）。以上结果说明，植物乳杆菌发酵液处理显著提高了双孢蘑菇POD和CAT活力（P＜0.05），增强了其抗氧化能力。

3 讨 论

组织褐变是影响双孢蘑菇品质的重要因素，菇盖在贮运过程中极易被擦伤，组织细胞结构遭到破坏，进而产生PPO催化酚类底物引起的酶促褐变和微生物侵染引起的病理褐变，最终导致菌盖表面颜色加深[7,22-23]。因此，控制褐变的主要措施是抑制酶的活力、降低底物浓度和提高组织抗病性。本研究采用植物乳杆菌发酵液将双孢蘑菇浸泡处理5 min，结果发现植物乳杆菌发酵液处理降低了PPO活力，并提高了贮藏后期的PAL活力，这一结果与刘吟[27]、王相友[28]等发现采用稳定态ClO2和可食性涂膜处理双孢蘑菇可降低PPO活力，从而抑制褐变的结果相一致；而PAL活力升高可能与抗病性有关，王淑霞等[29]研究表明，当植物受到病原菌侵染后，PAL活力被激发，迅速生成与抗病有关的植物保卫素、生物碱等生化物质，进而有效抑制病原菌的扩展[30]。

ROS迸发是机体衰老过程的重要事件，其能引起蛋白质损伤、膜脂过氧化、DNA突变等不可逆损伤，导致机体衰老，H2O2和·均是重要的ROS种类[25]。而POD和CAT作为抗氧化酶在清除自由基和ROS中起着重要作用。POD是一种以铁卟啉为辅基的酶类，在供电子体充足的条件下，可将低浓度的H2O2高效催化分解为H2O和O2[26]。CAT是一种含血红素的4聚体酶，其作用亦是在·分解为H2O2后，将H2O2催化分解，从而最大限度减少羟自由基的生成[25]。本研究发现，H2O2含量和抗O2-·活力在贮藏后期显著升高，CAT活力与H2O2含量呈负相关，表明ROS参与了双孢蘑菇的成熟衰老，而CAT活力可能受到H2O2调控；植物乳杆菌发酵液处理能有效降低H2O2含量、增强抗·活力和提高POD、CAT活力，表明植物乳杆菌发酵液通过抑制ROS积累、提高抗氧化酶活力延缓了双孢蘑菇的成熟衰老进程，从而较好地保持了双孢蘑菇品质。

4 结 论

双孢蘑菇在贮藏过程中会发生褐变，从而降低商品价值，而植物乳杆菌发酵液处理可以保持双孢蘑菇的色泽，抑制PPO活力并提高贮藏后期PAL活力，降低褐变程度。

与对照组相比，植物乳杆菌发酵液处理能有效降低H2O2含量、增强抗O2-·活力和提高POD、CAT活力，通过抑制ROS积累、提高抗氧化酶活力延缓了双孢蘑菇的成熟衰老进程，从而较好地保持双孢蘑菇品质。