贺军花，马利菁，周会玲*

（西北农林科技大学园艺学院，陕西 杨凌 712100）

灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的侵染性真菌病害，在果蔬采后贮藏中具有很高的发生频率，病原菌可通过机械伤口和花期两种途径侵染果蔬，潜伏至贮藏中后期发病[1]，给生产者造成了严重的经济损失，还形成了一定的食品安全隐患。目前控制灰霉病发生主要是使用化学杀菌剂，但化学杀菌剂会在果实表面残留，食品安全性得不到保障，长期使用还会使病原菌产生抗药性[2]。因此，探究苹果自身成分对灰霉病的抑制作用并加以利用是防治灰霉病的重要解决途径之一。

很多研究发现植物感染病原菌后体内总酚含量上升，某些单体酚含量上升尤为显著，酚类物质含量上升很可能是植物对病原菌应答的重要机制，而单体酚是病害应答和抗病的基础[3]。根皮苷是根皮素的葡萄糖苷，属于黄酮类中的二氢查耳酮类物质[4]。根皮苷是苹果属植物中特有的一种酚类物质，大量存在于叶片、果实和种子中，提取工艺简单，可获得性强，具有杀菌、抗氧化、抗癌、改善记忆力、降低血糖等[5-6]多种重要的生物活力，在食品、医疗保健以及化妆品行业中广泛应用。研究表明，根皮苷能抗植物的多种病原菌，如苹果黑星病、火疫病等[7]，在植物生长发育以及抗逆过程中也发挥着重要作用。张泽生等[8]研究表明，根皮苷能够增强超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活力，显著延长由高脂膳食导致氧化损伤的果蝇寿命。此外，根皮苷还可以抑制多元不饱和脂肪酸的氧化[9]，并作为平衡性核酸转运蛋白抑制剂，起到抗癌、抗病毒和保护心血管等作用[10]。同时，根皮苷在杀菌、保护神经系统、改善记忆等方面的作用也十分显著[11]。但有关根皮苷能否直接抑制病原菌的生长并作为外源激发子诱导植物系统抗性反应的报道较少。因此，本实验以体外接种B. cinerea研究根皮苷的抑菌作用，并通过分析发病过程中抗性相关酶活力和相关物质含量变化，探究根皮苷对苹果灰霉病的抑制作用，以期为根皮苷在采后病害抗性机理研究方面提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）由西北农林科技大学植物保护学院提供。将菌种在PDA培养基上进行继代培养，25 ℃下恒温避光培养9 d后，用体积分数0.05% Tween-80的无菌水制成浓度约为106个/mL的孢子悬浮液备用。

‘粉红女士’苹果（Malus domestica‘Pink Lady’）采于西北农林科技大学白水实验站，要求大小均匀、成熟度、着色基本一致，无机械损伤和病虫害。

L-苯丙氨酸、二硫苏糖醇、抗坏血酸、苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）美国Sigma公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、乙二胺四乙酸二钠 上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-LB型无菌操作台 苏净集团安泰公司；BCD-236DT型冰箱 青岛海尔股份有限公司；A11型液氮研磨仪 德国IKA公司；AUY220分析天平日本岛津公司；5810R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；HH-6数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；UV-1800紫外-可见分光光度计 科大中佳公司；KQ-500DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验处理

在离体实验基础上，最终确定1.0 g/L的根皮苷为活体实验的使用质量浓度，并进行下述处理：以体积分数70%乙醇擦拭果面，晾干后放入根皮苷溶液中浸泡20 min，取出后在室温（20±1）℃下诱导12 h，对照组用清水浸泡。用直径3 mm的消毒钉子在苹果赤道部位阴阳面均匀刺3 mm深的2 个伤口，在伤口处分别接种20 μL 106个/mL B. cinerea悬浮液，晾干后放入聚氯乙烯保鲜袋，室温条件下放置。固定30 个果实，统计发病率和病斑直径，重复3 次。其余果实，定期（0.0、0.5、1.0、1.5 d和2、3、5、7、9 d）取病斑周围1～2 cm内健康果肉组织，用液氮迅速冷冻后磨成粉末，装入锡箔纸袋中于-80 ℃保存，用于测定抗性相关酶活力及物质含量。

1.3.2 指标的测定

1.3.2.1 发病率、抑菌率和病斑直径的测定

菌落（病斑）直径利用游标卡尺进行十字交叉法测定，取平均值。以病斑直径大于等于3.5 mm确定为发病，发病率、抑菌率分别按式（1）、（2）计算。

1.3.2.2 PAL活力的测定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine amonialyase，PAL）活力的测定参考Han Cong等[12]的方法，略有改动。称取1.0 g果肉，加入2 mL 0.1 mol/L、pH 8.7的硼酸提取缓冲液（含40 g/L PVP、2 mmol/L EDTA和5 mmol/L β-巯基乙醇），冰浴条件下研磨成匀浆，于4 ℃、12 000×g离心30 min，上清液为粗酶提取液，4 ℃保存备用。取2 支试管，分别加入3 mL 50 mmol/L、pH 8.8的硼酸缓冲液和0.5 mL粗酶提取液，然后于一支试管中加入0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸，另一支加入0.5 mL的蒸馏水作为对照。将2 支试管于37 ℃温水中保温60 min，使生成反式肉桂酸，以0.1 mL 6 mol/L盐酸溶液终止反应。290 nm波长处分别测定反应管和对照管的吸光度，以每小时酶促反应体系吸光度增加0.01作为一个酶活力单位，单位为U/（h·g），以鲜质量计，实验重复3 次。

安徽地区复合肥较受农民欢迎，加上冬小麦播种影响，复合肥市场供应良好，价格相对比较乐观。同时，受原料价格上涨影响，复合肥价格有上涨趋势。有经销商反映，当地农民对于新型肥料抱有一定兴趣，如果经销商能在销售旺季做好推广示范和知识普及，销量有望进一步提高，经营方面的压力也将有所缓解。

1.3.2.3 POD、PPO活力的测定

过氧化物酶（peroxldase，POD）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的测定参考周晓婉等[13]的方法，POD活力在470 nm波长处测定吸光度，以每分钟吸光度变化1定义为一个酶活力单位，结果以U/（min·g）表示；PPO活力在420 nm波长处测定吸光度，以每分钟吸光度变化1定义为一个酶活力单位，结果以U/（min·g）表示。结果均以鲜质量计，实验重复3 次。

1.3.2.4 总酚、类黄酮含量的测定

总酚、类黄酮的含量分别分别参考Toor[14]和González-Aguilar[15]等的方法测定。称取1.0 g果肉，加入4 mL提取液（为体积分数1% HCl-甲醇，4 ℃预冷），研磨至匀浆，转入离心管中，在4℃下提取15 min，于4 ℃、12 000×g离心30 min。取上清液分别在280 nm和325 nm波长处测定吸光度，以每克鲜果肉在280 nm和325 nm波长处的吸光度来表示，分别计作A280nm和A325nm，实验重复3 次。

1.3.2.5 木质素含量的测定

参照周会玲等[16]的方法，以每克鲜果肉在280 nm波长处的吸光度（A’280nm）来表示，实验重复3 次。

1.3.2.6 H2O2含量的测定

H2O2含量的测定参照Takshak等[17]的方法，在390 nm波长处测定吸光度，单位为μmol/g，结果以鲜质量计，实验重复3 次。

1.4 数据分析

以SPSS 17.0软件进行数据分析，用Excel 2007软件作图。离体实验在ANOVA下用LSD分析法、活体实验用标准t检验进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 离体条件下根皮苷抑菌质量浓度的筛选

菌落是微生物在固体培养基上以母细胞为中心生长形成的可见集团，其直径是判断微生物生长状况的最直观指标。由表1可知，根皮苷处理组菌丝生长减慢，菌落直径小于对照组，且随着根皮苷质量浓度的增加，对B. cinerea的抑制能力也增强。接种后第3天，0.8、0.9 g/L和1.0 g/L根皮苷处理组没有菌落形成，对照组及0.5、0.6 g/L和0.7 g/L根皮苷处理组都有发病，但根皮苷处理组的菌落直径显著低于对照组，抑菌率分别为38%、59%和69%（P＜0.05）。接种后第4天和第6天，0.8 g/L根皮苷处理组和0.9 g/L根皮苷处理组分别有可见菌落形成，到第9天，1.0 g/L根皮苷处理组也并未有可见菌落形成。由此可见，根皮苷能够直接抑制B. cinerea的生长，当质量浓度达到1.0 g/L时可以完全抑制B. cinerea孢子的萌发，无菌落形成。通过预实验筛选发现此质量浓度也是活体处理的最佳质量浓度，因此，选用1.0 g/L作为本实验根皮苷使用的质量浓度。

表 1 根皮苷处理对体外接种B. cinerea菌落直径的影响Table 1 Effect of phlorizin treatment on the colony diameter of B. cinerea in vitro

2.2 根皮苷对苹果灰霉病的抑制作用

图 1 根皮苷处理对‘粉红女士’苹果采后灰霉病发病率（a）和病斑直径（b）的影响Fig. 1 Effect of postharvest phlorizin treatment on grey mold incidence (a)and lesion diameter (b) caused by B. cinerea in ‘Pink Lady’ apple fruits

发病率和病斑直径是判断防治效果的重要指标，可直观体现病害的发生情况。由图1a、b可知，根皮苷处理对苹果采后灰霉病发病率和病斑直径扩展有显著的抑制作用（P＜0.05），未经处理的果实在接种B. cinerea后发病率和病斑直径迅速增大，而处理组发病率和病斑直径增加较为缓慢。如图2a所示，在接种后第1天，处理组和对照组均有发病，对照组发病率接近20%，而处理组不足3%，两者之间差异极显著（P＜0.01）。其后，对照组发病率持续增加，接种后第5天，发病率已接近100%，而处理组发病率仅为61.1%，相比对照组降低了38.3%，差异极显著（P＜0.05）。至观察后期，对照组全部发病，处理组发病率也继续增加，但仍没有全部发病，与对照组相比差异显著（P＜0.05）。由图2b可知，与发病率变化相似，接种B. cinerea后，对照组病斑直径显著高于处理组，在接种后第5天，对照组的病斑直径就达到了11.10 mm，而处理组为9.53 mm，两组相比差异显著（P＜0.05）。其后，对照组的病斑直径迅速扩大，至测量后期达25.17 mm，而处理组病斑直径显著低于对照组（P＜0.05），比对照减小了4.53 mm。可见根皮苷处理可以有效降低苹果采后灰霉病的发生率，并抑制病斑直径的扩展。

2.3 根皮苷对果实抗性相关酶活力的影响

图 2 根皮苷处理对采后‘粉红女士’苹果果实抗性相关酶活力的影响Fig. 2 Effect of phlorizin treatment on resistance-related enzymes activities in postharvest ‘Pink Lady’ apples

PAL是许多中间抗菌物质生成的关键酶，其活力强弱常被用作植物抗性反应的重要指标。如图2a所示，经过根皮苷处理的果实PAL活力整体较对照组高，且两组酶活力都呈先升高后降低的趋势。在0.5 d时，对照组和处理组都达到一个小高峰，对照组酶活力为304.9 U/（h·g），处理组比对照组约高34.2 U/（h·g），两组差异极显著（P＜0.01）。之后对照组和处理组的PAL活力均有所降低，在1.5 d时同时下降到一个极小值，但处理组酶活力仍较对照组高25.3%，两者之间差异极显著（P＜0.01）。之后PAL活力又开始增加，并在2 d时达到峰值，后期缓慢下降，并趋于平缓。因此认为，根皮苷作为外源激发子可有效诱导苹果果实PAL活力的增加，以更好抵御灰霉菌入侵。

POD与植物体内活性氧代谢和木质素的合成紧密相关，可消除活性氧对植物细胞的伤害并催化木质素的最后一步合成。如图2b所示，处理组POD活力显著高于对照组（P＜0.05），且两组酶活力在整个时期都基本呈上升趋势，在0.5 d时同时达到一个小峰值，之后酶活力基本保持不变，在3 d后两组酶活力均迅速增加，处理组在7 d上升到峰值，比此时对照组酶活力高38.0%，两者之间差异极显著（P＜0.01）。可见，外源根皮苷的使用可有效诱导POD活力的增加，以消除活性氧对果实细胞的伤害，并促进木质素的合成。

PPO与植物体酚类代谢密切相关，可以将多种简单酚类物质氧化形成醌类。如图2c所示，在整个观察期，PPO活力整体呈现先降低再上升后下降的趋势，且处理组PPO活力始终较对照组高。在1.5 d时处理组PPO活力达到峰值，较此时对照组的酶活力高94.4%，两组之间差异极显著（P＜0.01）。之后酶活力开始下降，到7 d后又有上升的趋势。1 d时对照组PPO活力上升到一个峰值，仍然较此时的处理组酶活力低，两组之间差异显著（P＜0.05）。因此认为，根皮苷处理可显著诱导PPO活力的增加，促进醌类物质的积累，抵御病害的胁迫。

2.4 根皮苷对果实抗性相关物质含量的影响

图 3 根皮苷处理对采后‘粉红女士’苹果果实抗性相关物质含量的影响Fig. 3 Effect of phlorizin treatment on the contents of resistancerelated substances in postharvest ‘Pink Lady’ apples

总酚和类黄酮是植物体内直接的抑菌物质，其含量的变化代表着植物对外界刺激的应答能力。经过根皮苷处理的果实中总酚含量整体高于对照组（图3a）。在接种B. cinerea后，处理组总酚含量上升较快，1.5 d达到一个峰值，此时处理组的总酚含量极显著高于对照组（P＜0.01）。之后处理组的总酚含量有所下降，5 d时出现一个极小值，然后呈上升-下降的波动趋势。而对照组总酚含量整体呈缓慢上升的趋势，在后期略有下降，再缓慢上升，至观察末期仍有上升的趋势。

如图3b所示，与总酚含量变化相似，根皮苷处理组的类黄酮含量整体较对照组高，且处理组和对照组类黄酮含量总体呈现先升高后降低再升高的趋势。处理组类黄酮含量在最初就较对照组高，其后两组类黄酮含量都有所增加，至接种1 d，处理组类黄酮含量达到一个峰值，较此时对照组类黄酮含量高18.0%，之间差异极显著（P＜0.01）。其后处理组和对照组类黄酮含量都有所下降，但处理组含量仍较对照组高。在2 d时，处理组和对照组类黄酮含量都下降到一个较低水平，之后又开始上升，虽然对照组较处理组上升快，但之间并无显著差异（P＞0.01）。由此可见，根皮苷处理可有效增加果实体内总酚和类黄酮的积累。

木质素作为植物防御系统的重要组成成分，在强固细胞壁和增加抗性上起十分重要的作用。经过根皮苷处理的果实木质素含量在整个观察期都较对照组高（图3c），两者都是先升高到一个峰值，再下降后又升高。根皮苷处理组在1.5 d时木质素含量积累到一个最大水平，比此时对照组木质素含量高约69.5%，两者之间差异极显著（P＜0.01）。其后木质素的积累逐渐减少，在第5天减少到一个极小值后又开始增加，并在观察末期达到与峰值接近的水平。对照组在2 d时达到一个极大值，之后迅速下降，第5天开始，木质素含量又快速积累，至第9天时上升到一个略低于处理组的水平。可见根皮苷处理可有效增加果实木质素的含量，以更好抵御灰霉病入侵。

植物在受到不良环境胁迫时，体内迅速积累H2O2参与抗逆反应的启动和诱导过程，直接或间接导致膜脂过氧化，加速细胞的衰老和解体。如图3d所示，处理组和对照组H2O2含量整体呈现先上升后下降的趋势，且处理组H2O2含量整体较对照组低。接菌后处理组H2O2含量开始上升，在1 d时达到峰值，与此时对照组的H2O2含量基本相同，之后处理组H2O2含量开始下降，而对照组继续上升，在1.5 d时达到一个峰值，较此时处理组含量高4.40 μmol/g，两组之间差异极显著（P＜0.01）。其后处理组和对照组H2O2含量都呈现上升-下降的波动趋势。因此认为，根皮苷处理可有效降低H2O2的生成，降低膜脂过氧化程度，减缓果实的衰老死亡过程。

3 讨 论

外源黄酮类物质处理苹果果实可以有效减弱灰霉菌的致病能力，降低损伤接种B. cinerea果实的发病率和抑制病斑直径的扩展，并诱导果实中防御相关酶类活力的升高和抗性相关物质含量的增加[18]。根皮苷是黄酮类物质的重要组成成分，作为杀菌剂和抗氧化剂而广泛应用。通过体外实验研究发现，培养基中所含根皮苷质量浓度与B. cinerea的生长呈负相关（R2＝0.959）。随着根皮苷质量浓度的增大，对B. cinerea的抑制效果越明显，B. cinerea菌落形成的时间延迟，直径减小。当根皮苷质量浓度达到1.0 g/L时，培养基上无B. cinerea菌落的形成。由此可见，1.0 g/L的根皮苷可完全抑制B. cinerea的生长。通过活体实验研究发现，1.0 g/L的根皮苷溶液浸泡处理可有效降低‘粉红女士’苹果果实发病率，抑制病斑直径扩展，显著改善果实发病情况。在刚接种B. cinerea时，果实表面附着的根皮苷和渗透进入果肉浅表面的根皮苷可接触B. cinerea，对其起直接毒杀作用，在一定程度上可抑制病原菌在果实上的定植生长。随着接种时间的延长，病原菌在果实上生长繁殖，其侵染范围由近及远、由外而内，根皮苷的这种直接毒杀效果减弱，B. cinerea的入侵速率较初期显著增加（P＜0.05），但处理组的病斑直径仍然低于对照组，可见根皮苷处理能够显著改善果实灰霉病的发生情况。

PAL作为非特异酶参与了由多途径激发子诱导植物的抗性反应，可增强植物对不良因子的抵御能力[19]。本研究发现根皮苷处理组PAL活力整体较对照组高。在接菌0 d时，处理组的果实PAL活力较对照组高7.33%，之间差异显著（P＜0.05）。可见，根皮苷处理可直接诱导PAL活力增加，与病原菌的侵染与否无关。根皮苷对苹果果实的这种诱导反应可在B. cinerea刚入侵时有效减缓B. cinerea的侵染速率。之后，处理组PAL活力整体仍较对照组高，可能一方面是根皮苷的继续诱导作用，另一方面是果实本身对病原菌入侵的系统抗性反应；而对照组酶活力的改变仅仅依靠果实的系统抗性反应，因此显著低于处理组的酶活力（P＜0.05）。这与以外源激发子处理甜瓜的结果相似[20]。PAL作为苯丙烷代谢途径的第一关键酶，活力的改变是植物诱导抗性反应的重要表现之一[21]，其下游途径产生的酚类和类黄酮具有杀菌、抗病毒、清除自由基等多种生物活性，参与果实的防御反应[22]。但植物体本身的酚类物质含量与抗性并不直接相关，诱导产生的酚类物质的变化与抗病性密切相关[23]。本实验研究发现，在实验处理初期根皮苷处理组和对照组的总酚含量无显著差异，而类黄酮的含量差异显著（P＜0.05）。可能是附着在苹果果实表面的根皮苷通过气孔和细胞间隙进入果肉的浅表层，而取样部位在靠近果面1～2 cm的深度，渗透进果肉浅表皮的这部分根皮苷刚好处于取样范围；因此，在接种0 h时，处理组的类黄酮含量就显著高于对照组（P＜0.05）。接菌后，处理组和对照组PAL活力改变，影响总酚和类黄酮的合成过程，而PPO活力的改变，使总酚和类黄酮氧化生成醌类物质，再经过非酶聚合反应生成黑色素[24]的过程发生变化，这两个酶协同作用使得总酚和类黄酮的积累改变，果实的抗性能力随之改善。这与前人研究猕猴桃[25]、柑橘[26]上的诱导抗性反应结果表现一致。可见，外源激发子处理能够有效诱导植物体PAL和PPO活力的改变，调节总酚和类黄酮合成代谢途径，从而使植物抗病能力增加。

POD在木质素合成中起重要的作用，催化了木质素最后一步的合成[27]，并在活性氧代谢中也发挥了重要作用，可有效消除活性氧对细胞膜脂的伤害，减缓细胞的衰老死亡过程。侯珲等[28]研究发现经过草酸、水杨酸和苯并噻二唑处理后甜瓜体内的POD活力上升十分显著，植物体的抗性增加。本研究发现，根皮苷处理组POD活力始终保持在一个较对照组高的水平，从而促进了木质素的合成，阻碍病原菌的继续入侵，并有效降低了H2O2的积累，减弱了果实细胞膜脂过氧化程度。接种B. cinerea后，根皮苷处理组和对照组POD活力开始上升，促进木质素的积累，从而抑制病原菌生长，干扰外多聚半乳糖醛酸的降解，并使侵入的菌丝木质化[29]，但对照组POD活力和木质素含量始终低于处理组（P＜0.05）。活性氧的产生是植物接受逆境信号的首要表现，可破坏植物细胞膜以及蛋白质和核酸的结构，造成植物体的不可逆伤害[30]。Huan Chen等[31]研究发现，经过热激处理的桃果实中H2O2含量明显减少，对果实细胞的伤害也降低，果实的抗性得到改善。本研究发现，在接种B. cinerea后，H2O2的含量在接种后初期呈直线上升趋势，但处理组的H2O2含量低于对照组，主要是处理组POD活力较对照高，将H2O2分解的速率较快，膜脂过氧化程度低于对照组，果实细胞的衰老死亡过程也较对照组缓慢。因此认为，外源根皮苷处理有效诱导了POD活力的改变，从而促进木质素的合成积累，增加果实的物理抗病能力，并减少H2O2的积累，降低了H2O2对果实细胞膜脂的伤害，延缓了果实细胞的衰老凋亡过程，从而改善了果实的抗病能力。

4 结 论

根皮苷对灰霉菌具有直接的抑制作用，1.0 g/L根皮苷可以完全抑制灰霉菌的生长，同质量浓度根皮苷可作为外源激发子显著降低果实的发病率，抑制果实病斑直径的扩大，并有效诱导了抗性相关酶PAL、POD和PPO活力的变化，从而增加了总酚、类黄酮和木质素的积累，显著降低H2O2的含量。通过这一系列防御酶和防御物质的变化，协同作用于病原菌，从而改善果实的抗病能力，防预果实病害的发生。