黄海波，沈圳煌，耿倩倩，史培颖，吴珍红,4，孙燕如，韩鸣凤，缪晓青,4,*

（1.福建农林大学蜂疗研究所，福建 福州 350002；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；3.天然生物毒素国家地方联合工程实验室，福建 福州 350002；4.福建农林大学蜂学学院，福建 福州 350002）

顺铂由于其抗癌谱广、作用强且可以和多种抗肿瘤药物一同作用的特点，是目前最常用的抗肿瘤药物之一[1]。但由于顺铂对细胞杀伤不具有特异性，因此在使用顺铂治疗癌症的同时也会对正常细胞造成损伤，产生较强的毒副作用[2]，这大大限制了顺铂在临床上的运用。研究表明顺铂造成机体损伤的主要机制之一是氧化应激作用，表现为顺铂可以降低抗氧化酶的活力，诱导脂质过氧化物产生[3-4]。一些国内外学者曾研究了藏红花素[5]、灯盏花素[6]、咖啡酸苯乙酯[7]、蜂王浆[8]、槲皮素[9]、VC[10]、VE[11]等天然或人工合成的抗氧化剂对顺铂造成的损伤的保护作用，结果表明这些抗氧化剂可以很好地减少顺铂造成的损伤。

蜂胶是一种具有芳香气味和黏性的胶状固体物质，在很久以前就已作为民间药物使用[12]。蜂胶具有很好的抗氧化[13]、抗癌[14]、抗菌[15]、抗炎[16]、保肝[17]等生物学活性和药理活性。尤其是抗氧化活性，近年来国内外学者就蜂胶的抗氧化活性做了广泛的研究，发现蜂胶能有效清除自由基，缓解机体的氧化应激[13,18]。咖啡酸苯乙酯、槲皮素被认为是蜂胶中的主要活性成分，蜂胶的许多生物活性均认为与这些成分有关[19]。Kus[7]和Almaghrabi[9]等分别研究了咖啡酸苯乙酯、槲皮素等成分对顺铂毒性的干预作用，发现这些物质可以有效干预顺铂所致的损伤。但目前国内还没有蜂胶干预顺铂诱导氧化损伤的报道。因此，本实验将初步探究蜂胶对顺铂所致肝、肾损伤的干预作用。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

成年健康雄性清洁级S D大鼠2 5 只，体质量（180～200）g，购买于上海斯克莱实验动物有限公司，动物合格证编号：2015000522002，许可证号码：SCXK（沪）2012-0002。

粗蜂胶 神蜂科技有限公司；顺铂 济南齐鲁制药有限公司；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、铁离子还原力法（the ferric reducing antioxidant power，FARP）、2,2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度试剂盒、苏木精-伊红染色液 南京建成生物有限公司；戊巴比妥钠、石蜡、无水乙醇、二甲苯、芦丁标准品、没食子酸标准品 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

TA203H普通天平 常州市幸运电子设备有限公司；3K15冷冻离心机 美国Sigma公司；SCIENTZ-48高通量组织研磨器 宁波新芝生物科技有限公司；T6新世纪可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Infinite 200 PRO全波长酶标仪 瑞士Tecan公司；YD-202组织切片机 浙江金华益迪医疗设备厂；B2032ED显微镜 重庆奥特光学仪器有限公司 ；LGJ-18S冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；RE52CS旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DW-86L338超低温冰箱青岛海尔特种电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂胶提取物的制备

参考沈菲等[15]的方法略有修改。将粗蜂胶置于-20 ℃冰箱中冷冻2 h以上，使用中药粉碎机粉碎后，按1∶10（m/V）加入体积分数70%乙醇，浸渍96 h，过滤除杂。40 ℃真空旋转蒸发去除乙醇，然后放入60 ℃烘箱干燥至恒质量。之后放入冷冻干燥机中-50 ℃下冷冻干燥，得到蜂胶提取物冻干粉（ethanolic extract of propolis，EEP）。

1.3.2 EEP成分及其抗氧化活性

1.3.2.1 总黄酮含量测定

根据王烁等[20]的方法，将2 m L稀释后的E E P与0.4 m L 5% N a N O2反应6 min后，加入0.4 mL 10% Al(NO)3，静置6 min，再加入1 mol/L NaOH 4 mL，定容至10 mL，以芦丁作为标品，绘制标准曲线，平行3 次测定样品。

1.3.2.2 总酚含量测定

根据颜小捷等[21]的方法，使用福林-酚法对EEP总酚含量进行测定。将1 mL样品与1 mL福林-酚反应5 min后，加入1.5 mL 20% Na2CO3，加双蒸水定容至10 mL，室温避光放置10 min后于760 nm波长处测量，以没食子酸作为标准品，绘制标准曲线，平行3 次测定样品。

1.3.2.3 ABTS+•清除实验

根据试剂盒说明书测定EEP稀释液的自由基清除能力。以Trolox作为标准品，绘制标准曲线，平行3 次测定样品。

1.3.2.4 FRAP总抗氧化能力实验

根据试剂盒说明书测定EEP稀释液的还原能力。以FeSO4•7H2O的水溶液作为标品，绘制标准曲线，平行3 次测定样品。

1.3.3 动物分组及处理

SD大鼠饲养期间，环境温度为（25±2）℃，可自由饮水和摄食。适应性喂养5～7 d后，将25 只大鼠随机分为5 组，每组5 只：对照组、模型组、蜂胶低、中、高剂量组。蜂胶给药组每天分别给予50、100、150 mg/kg mb的蜂胶提取物。给药前将蜂胶溶解在含有5%无水乙醇、10%吐温-80的水溶液中。对照组、模型组每天灌胃等量不含蜂胶的溶剂。给药周期为12 d，其中第7天给药2 h后，除对照组外其余各组腹腔注射10 mg/kg mb的顺铂诱发肝、肾损伤；第13天早上大鼠麻醉后处死，取血液和肝、肾组织，用于后续各项指标的测定和分析。

1.3.4 血清肝、肾功能指标的测定

SD大鼠解剖后腹主动脉取血，待血液分层后，放在冷冻离心机中，4 ℃、3 000 r/min离心10 min制备血清。所得到的血清用试剂盒对AST、ALT活力和BUN、Cr含量进行测定。

1.3.5 肝、肾组织氧化应激指标及抗氧化酶指标的测定

分别取0.1 g肝、肾组织，按1∶9（m/V）的比例加入预冷后的生理盐水，使用高通量组织研磨器进行匀浆。匀浆后放在冷冻离心机中，4 ℃、3 000 r/min离心10 min。取上清液使用BCA蛋白浓度试剂盒测定10%匀浆液的蛋白浓度。之后按照试剂盒说明书分别对肝、肾组织匀浆液中SOD、CAT的活力，MDA、iNOS、GSH的含量进行测定。

1.3.6 肝、肾组织病理学检验

解剖后将大小适中的肝、肾组织浸泡在10%的中性甲醛溶液中，充分固定后经脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、展片、捞片、烤片、脱蜡、复水、苏木素染色、洗脱、伊红复染、清洗、晾片、封片一系列步骤后，通过光学显微镜观察肝、肾组织病理学的变化，使用显微镜数码相机进行拍照。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 EEP的成分及抗氧化活性

测定结果表明实验所用的E E P总黄酮含量为（122.35±7.40）mg/g、总酚酸含量为（241.42±9.80）mg/g。ABTS值为（466.1±12.7）mg/g（Trolox当量）、FARP还原能力为2.35 mmol/g。

由测定结果结合玄红专等[22]的报道可知实验所用的蜂胶具有较高的总黄酮、总酚含量，具有较好的清除自由基和还原能力，是一个很好的天然抗氧化剂。

2.2 EEP对顺铂所致大鼠肝、肾功能损伤的影响

血清中AST、ALT、BUN、Cr含量的高低可分别反映肝脏、肾脏的损伤程度。由表1可知，模型组血清中AST、ALT活力和BUN、Cr的含量均高于对照组，且具有统计学意义。说明注射顺铂后，对大鼠的肝脏、肾脏造成了一定程度的损伤。而相比于模型组，蜂胶给药组可以有效抑制顺铂对肝、肾造成的损伤。高剂量组血清中AST、ALT、BUN、Cr的数值与对照组相比仍有显著性升高，但是明显低于模型组，具有统计学意义。

表 1 蜂胶对顺铂导致肝、肾损伤大鼠血清BUN、Cr含量和ALT、AST活力的影响（n＝5）Table 1 Effect of EEP on serum BUN, Cr, ALT and AST levels in rats with cisplatin-induced hepatoxicity and nephrotoxicity (n= 5)

2.3 EEP对顺铂所致大鼠肝、肾组织SOD活力和MDA含量的影响

大鼠肝、肾组织中MDA含量可反映机体脂质过氧化的情况，SOD作为体内抗氧化防御系统的主要酶类，它的活力高低直接反映机体清除自由基的能力[5]。

表 2 蜂胶对顺铂导致肝损伤大鼠肝组织匀浆SOD活力和MDA含量的影响（n＝ 5）Table 2 Effect of EEP on SOD and MDA in liver tissue of rats with cisplatin-induced hepatoxicity (n= 5)

表 3 蜂胶对顺铂导致肾损伤大鼠肾皮质组织SOD活力和MDA含量的影响（n＝5）Table 3 Effect of EEP on SOD and MDA in renocortical tissue of rats with cisplatin-induced nephrotoxicity (n= 5)

由表2、3可知，模型组肝、肾组织中的SOD活力较对照组明显降低，MDA含量有明显升高。组织中SOD活力的降低会使脂质过氧化反应增强，而MDA含量的升高则会加剧脂质过氧化速率，从而致使组织发生急性氧化损伤。当给药蜂胶后，大鼠肝、肾组织的氧化损伤情况有明显好转。低、中、高3 个剂量组中，肝、肾组织中的SOD活力较模型组均有显著升高，活力与蜂胶给药剂量呈正相关。蜂胶组肝、肾组织中MDA含量较模型组来说有所降低，其中高剂量组中MDA含量与模型组相比显著性降低。说明给药蜂胶后可以降低顺铂造成的氧化损伤。

2.4 EEP对顺铂所致大鼠肝、肾组织氧化应激和抗氧化酶系的影响

表 4 蜂胶对顺铂导致肝损伤大鼠肝组织匀浆GSH含量、CAT、iNOS活力的影响（n＝5）Table 4 Effect of EEP on GSH, CAT and iNOS in liver tissue of rats with cisplatin-induced hepatoxicity (n= 5)

表 5 蜂胶对顺铂导致肾损伤大鼠肾皮质组织GSH含量、CAT、iNOS活力的影响（n＝ 5）Table 5 Effect of EEP on GSH, CAT and iNOS in renocortical tissue of rats with cisplatin-induced nephrotoxicity (n= 5)

组织中iNOS活力可反映机体的氧化应激情况，而体内GSH的含量和CAT的活力可以反映机体的抗氧化能力[23]。由表4、5可知，模型组肝、肾组织中iNOS的活力较对照组有显著提高，给药蜂胶后组织中活力逐步降低，呈剂量依赖性关系，高剂量组较模型组显著性降低。模型组的肝、肾组织中GSH的含量和CAT的活力较对照组显著降低，给药蜂胶后数值逐步升高，高剂量组较模型组显著提高。实验结果表明蜂胶可提高机体抗氧化酶的活力，从而有效降低顺铂引起的氧化应激作用。

2.5 EEP对顺铂造成大鼠肝、肾组织病理学的影响

图 1 大鼠肝脏组织病理学变化（100×）Fig. 1 Histological changes of liver tissue (100 ×)

由图1可知，对照组大鼠的肝小叶结构清晰，肝细胞结构正常。模型组则出现肝小叶坏死，肝细胞气球性变性，伴随着大量的炎性细胞浸润。EEP给药组较模型组损伤减轻，高剂量组减轻作用明显，可见细胞整齐排列。

图 2 大鼠肾脏组织病理学变化（100×）Fig. 2 Histological changes of kidney tissue (100 ×)

由图2可知，对照组肾小管、肾小球清晰可见，没有观察到上皮脱落等症状。而模型组的肾脏组织出现明显的肾小管病变情况，包括肾小管上皮细胞空泡变性，上皮细胞脱落，细胞间质出现炎症反应。蜂胶给药组大鼠肾脏病变情况较模型组有改善。高剂量组大鼠的肾脏结构与正常大鼠肾组织接近。

3 讨 论

顺铂是目前最常用的抗肿瘤药物之一，可以通过抑制癌细胞的DNA复制过程、损伤细胞膜结构达到抗癌的作用，临床上将其用于治疗卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、肺癌等多种实体肿瘤[24]。但使用顺铂治疗癌症的同时也会对正常细胞造成损伤产生较强的毒副作用，对肝、肾、耳乃至神经都会造成损伤[25-26]。

由于顺铂会对肝、肾造成一定程度的损伤，因此用AST、ALT、BUN、Cr这些临床上判断肝、肾是否正常的指标来研究蜂胶对顺铂毒性的降低作用。AST和ALT是最常用于诊断肝细胞受损的指标，它们的升高是肝细胞受损的重要标志[27]。BUN、Cr是判断肾功能的常用指标，分别具有很高的敏感性和特异性，其值的高低可准确反映肾功能的和损害程度，对于肾功能损伤早期诊断、治疗和预后具有重要意义[28]。实验结果表明，相比于对照组，模型组AST、ALT、BUN、Cr这些指标均显著提高，说明顺铂对大鼠的肝、肾造成了一定程度的损伤。而相比于模型组，蜂胶给药组的这些指标均显著性降低，说明蜂胶提取物可以有效降低顺铂造成的肝、肾损伤。

此外，从肝、肾的组织病理学方面来看，相比于对照组，模型组的肝、肾组织都出现了病变情况，具体表现为肝小叶细胞坏死，肾小球细胞脱落、空泡性，肝、肾病理学切片中均发现炎性细胞浸润等情况。而蜂胶给药组的这些病变情况均有不同程度降低。由此可知，对大鼠给药蜂胶提取物可以有效降低由于顺铂造成的肝、肾损伤。

研究表明氧化应激是顺铂毒性的主要机制之一，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）介导的氧化应激在顺铂毒性中具有重要的作用[29]。一旦顺铂进入细胞内，会使DNA和蛋白质发生损伤，生成过量的ROS，导致生物膜正常功能被破坏[24]。顺铂能与抗氧化系统相互作用，影响抗氧化系统和抗氧化酶系，导致不同组织发生氧化损伤，氧化应激反应程度和组织结构损耗的轻重呈明显的正相关[30]。

正常情况下，机体内产生的自由基会被细胞内的抗氧化酶如SOD、CAT清除，从而保证机体内自由基的生成和清除达到平衡[9]。当机体内自由基积累过多，不能及时被抗氧化酶类清除时，就会破坏自由基与机体防御系统之间的平衡，从而促进脂质过氧化过程，引起细胞损伤。脂质过氧化过程的主要产物是MDA，因此组织中MDA的含量可以一定程度上反映机体脂质过氧化的程度，也间接表明机体内自由基与抗氧化防御系统的平衡情况[10]。iNOS参与体内NO的合成，当机体处于氧化应激状态时iNOS的表达量增加，导致过量的NO生成，过量的NO容易引起脂质过氧化[23]。GSH、SOD、CAT是机体抵御自由基的重要防线，在清除自由基、维持机体内自由基平衡、防止氧化应激和清除脂质过氧化物积累等方面起着重要作用。组织中这些酶的活力可作为衡量抗氧化能力的指标。研究表明顺铂可以降低大鼠肝脏、肾脏中GSH的含量，抑制SOD、CAT等酶的活力，从而使脂质过氧化产物积累引起机体损伤[31]。

由于蜂胶具有很好的抗氧化作用，可作为天然的抗氧化剂使用，故本实验从抗氧化角度研究其对顺铂造成肝、肾损伤的干预作用。实验结果表明，在腹腔注射顺铂之后，与对照组相比，顺铂可引起肝脏、肾脏的氧化损伤造成脂质过氧化物的大量产生，降低体内抗氧化酶的活力，这与Li Chengzhen[32]和Kart[33]等的实验结论相一致。给药蜂胶之后，肝、肾组织中MDA、iNOS较模型组有明显的降低，GSH的含量、CAT、SOD等酶的活力均有显著性提高，说明蜂胶可以通过降低顺铂造成的氧化损伤，从而降低顺铂对肝、肾的损伤。

综上所述，本研究从提高机体抗氧化能力、降低体内氧化应激等角度，表明蜂胶可以有效地降低顺铂造成的肝、肾毒性。但是具体的作用机制还不清楚，有待于从分子角度更进一步进行研究。本研究为临床上找到一种可以降低顺铂造成肝、肾损伤的药物和食品，也扩宽了蜂胶的应用范围，为蜂胶的综合开发利用提供了实验依据。