铁珊珊，刘梦培，纵 伟*，张丽华，赵光远

（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南 郑州 450002）

原花青素又称缩合单宁，主要存在于水果和蔬菜中，例如葡萄、苹果和洋葱等，是人类饮食的重要组成部分[1-3]。它具有抗氧化、清除自由基、抑制低密度脂蛋白氧化、减少心肌缺血再灌注损伤等生物活性，被广泛应用于药物、化妆品和食品等领域[4-5]。按照聚合度的大小，通常将聚合度2～4的称为低聚原花青素，将四聚体以上的称为高聚原花青素[6]。低聚体可以在体内被消化吸收，而高聚体则不能，然而，产品中的原花青素主要为高聚体，导致原花青素的生物利用度极低[7-8]。

目前主要采用以下方法提高原花青素的生物利用率和产品附加值：1）将提取出来的原花青素进一步分离和富集获得低聚原花青素，主要采用树脂吸附分离和膜分离法，但高聚体得不到有效利用[9-10]；2）将高聚原花青素降解为低聚原花青素，主要有生物降解法以及碱性降解法、苄硫醇降解法等化学方法，但反应激烈，容易造成产品结构破坏[3,11-12]。动态高压微射流均质技术（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）是一种特殊形式的物理高压均质技术，具有能耗低、污染少、改善多聚体结构、不同压力作用样品性质变化不同等优点[13-15]。Sun Cuixia等[16]研究发现采用DHPM处理玉米蛋白乙醇溶液会改变玉米蛋白的结构性质；张博[17]研究发现蜡质淀粉经DHPM处理后分子链发生断裂，分子质量有所下降。而DHPM这一物理改性技术对原花青素性质的影响鲜有报道。因此，本实验主要采用DHPM处理原花青素溶液，研究处理压力和次数对原花青素的平均聚合度以及抗氧化性能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原花青素（纯度≥98%） 山东康美药业有限公司；儿茶素标准品 天津市尖峰天然产物研究开发有限公司；VC、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、铁氰化钾、三氯乙酸、香草醛等均为分析纯 国药集团有限公司。

1.2 仪器与设备

FPG12800高压纳米均质机 安盛联合科技有限公司；XY-FD-18真空冷冻干燥机 上海欣谕仪器有限公司；T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将10 g原花青素溶于蒸馏水中，定容至1 000 mL。

1.3.2 DHPM处理

采用DHPM将原花青素水溶液在不同的处理压力（100、140、180、220 MPa和260 MPa）分别下进行1、2、3、4 次循环处理，接着将其进行冷冻干燥，获得不同处理条件下的样品。与未经高压处理的样品（对照组）进行比较分析。

1.3.3 原花青素平均聚合度的测定

准确称量1 mg样品，根据彭芳刚等[18]的方法测定原花青素的平均聚合度：采用传统的香草醛-甲醇法测定原花青素的质量，以儿茶素为标准品，获得吸光度与儿茶素质量浓度之间的线性关系为y＝0.305 7x+0.010 1，R2＝0.998 2；采用香草醛-乙酸法测定原花青素物质的量，吸光度与儿茶素物质的量浓度之间的关系为y＝1.177 3x+0.028 2，R2＝0.996 9，按照下式算出原花青素的平均聚合度。

式中：m为原花青素的质量/µg；n为原花青素物质的量/µmol；M为单体儿茶素的摩尔质量（290 g/moL）。

1.3.4 铁还原力的测定

参照文献[19]中的方法测定原花青素的铁还原力。

1.3.5 清除DPPH自由基能力的测定

参照文献[20]中的方法测定原花青素清除DPPH自由基的能力。

1.4 数据分析

采用Origin 8.5、SPSS软件处理实验数据，结果采用平均值±标准差表示，Duncan法分析差异显著性，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 原花青素平均聚合度分析

聚合度是衡量原花青素的重要品质之一[21]。图1为100、140、180、220、260 MPa下分别进行1、2、3、4 次循环处理前后原花青素的平均聚合度。

图 1 处理压力和次数对原花青素平均聚合度的影响Fig. 1 Effects of different processing pressure levels and cycles on the degree of polymerization of proanthocyanidins

由图1可知，不同处理条件下原花青素的聚合度不同，未经超高压处理的原花青素平均聚合度为3.85，经超高压处理后原花青素的平均聚合度均低于2.00，两者之间存在显著差异（P＜0.05），可能是由于超高压处理过程中，高聚原花青素的氢键等非共价键发生断裂，导致原花青素的平均聚合度下降，该结论与梁瑞红等[22]关于DHPM处理对低酯果胶分子质量的影响研究结果一致。随着处理压力的升高，原花青素的平均聚合度之间总体不存在显著差异，但从其数值上来看，220 MPa下原花青素的平均聚合度相对较低；压力为100、140 MPa时，平均聚合度随着处理次数增加呈下降趋势，压力为180、220 MPa时，随着处理次数增加，平均聚合度则无明显变化规律，但4 次处理条件下样品的平均聚合度最小，260 MPa下平均聚合度呈现先增加后下降的趋势。处理压力为220 MPa，次数为4条件下获得的平均聚合度最低（1.32），显著低于其他处理条件下的聚合度（P＜0.05）。

2.2 抗氧化能力分析

根据DHPM不同处理压力和次数对原花青素平均聚合度的影响，选择处理次数为4条件下的不同处理压力进行抗氧化能力分析，比较其与对照组以及VC抗氧化能力之间的差异。

2.2.1 铁还原力分析

在食品体系中，一些过渡金属在自由基形成的过程中可以作为催化剂，其中亚铁离子是最有效的助氧化剂，具有极高的反应活性。因此铁还原力的测定通常用来评价天然抗氧化剂的供电子能力，可以反映样品的抗氧化能力[23]。

由图2可知，同一质量浓度不同处理条件下原花青素的铁还原能力不同，随着质量浓度的升高，样品的吸光度增大，吸光度与样品的还原力呈正相关，样品的吸光度越大，表明其还原力越强[24]；在测定的质量浓度范围内原花青素的铁还原能力均高于VC对照品；经高压处理的原花青素铁还原力均高于未经高压处理的原花青素。铁还原能力顺序为：220 MPa＞180 MPa＞140 MPa＞100 MPa＞260 MPa＞对照组＞VC。样品质量浓度为12.5 µg/mL和25.0 µg/mL时，处理压力为100、140、220、260 MPa条件下的原花青素铁还原力之间不存在显著差异（P＞0.05）。当样品质量浓度为50.0、100.0 µg/mL时，100、140 MPa下获得的原花青素铁还原力之间不存在显著差异（P＞0.05）；当样品质量浓度为75 µg/mL时，样品之间不存在显著性差异，但均高于VC的还原能力（P＜0.05）。总之，不同处理压力下的原花青素铁还原力存在一定差异。

2.2.2 清除DPPH自由基能力分析

DPPH自由基清除能力是当前检测样品抗氧化能力使用最为广泛的指标，原花青素的质量浓度和抗氧化能力与DPPH自由基清除率呈正相关[25]。

图 3 不同处理压力下原花青素对DPPH自由基的清除能力Fig. 3 DPPH radical scavenging capacity of proanthocyanidins at different processing pressures

由图3可知，不同压力下原花青素的自由基清除能力不同，在1.0～20.0 µg/mL范围内，对DPPH自由基清除能力呈现明显的剂量依赖效应关系，然后随着质量浓度的增加，DPPH自由基清除能力增速减慢；原花青素的清除能力均高于相同质量浓度下的VC对照组；经高压处理的原花青素清除能力均高于相同质量浓度下未经高压处理的样品。DPPH自由基清除能力顺序为：220 MPa＞180 MPa＞140 MPa＞100 MPa＞260 MPa＞对照组＞VC。在质量浓度为1.0 µg/mL时，处理压力为140 MPa（清除率13.13%）、180 MPa（13.23%）、220 MPa（14.48%）条件下原花青素的DPPH自由基清除能力不存在显著差异（P＜0.05），但220 MPa下原花青素的清除能力相对较高；质量浓度为2.5 µg/mL时，100 MPa（23.47%）、140 MPa（23.92%）、180 MPa（23.84%）、220 MPa（23.90%）条件下原花青素的DPPH自由基清除能力不存在显著差异（P＜0.05）；在质量浓度为5.0、10.0、20.0 µg/mL时，100、140、180、220 MPa下原花青素的清除能力无显著差异，但在质量浓度为20.0 µg/mL时，220 MPa下原花青素的自由基清除能力达到90%的清除效果；在质量浓度为40.0 µg/mL时，所有样品的自由基清除能力均超过90%，且不存在显著差异。

2.2.3 原花青素抗氧化能力的IC50

原花青素铁还原力半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为抑制率达到50%时样品的质量浓度[26]。

由表1可知，700 nm波长处吸光度随原花青素质量浓度的增加而升高，且相关系数R2值均大于0.990 0，说明还原力与原花青素质量浓度呈良好的线性关系。根据回归方程可以得知不同样品的IC50，220 MPa下原花青素的铁还原力IC50为42.7 µg/mL最小，未经高压处理的IC50最大为51.7 µg/mL，均小于阳性对照组VC的52.7 µg/mL，IC50越小表示样品清除自由基能力越强，反之样品清除自由基能力弱[27]；因此220 MPa下原花青素的铁还原能力最强。

表 1 不同处理压力下原花青素及VC的铁还原力IC50Table 1 IC50 for ferrous ion chelating activity of proanthocyanidins at different processing pressures and VC

原花青素DPPH自由基清除能力IC50为清除率达到50%时所需要的抗氧化剂质量浓度[27]。本实验中，原花青素DPPH自由基清除能力IC50由小到大依次为：220 MPa（6.469 µg/mL）＜180 MPa（6.929 µg/mL）＜140 MPa（7.183 µg/mL）＜100 MPa（7.481 µg/mL）＜260 MPa（7.831 µg/mL）＜对照组（7.866 µg/mL）＜VC（8.644 µg/mL）。IC50越小抗氧化能力越强，说明220 MPa下原花青素的抗氧化能力最强。

3 结 论

通过分析处理压力和次数对原花青素平均聚合度的影响可知，DHPM处理会破坏原花青素的分子结构，使其平均聚合度降低。随着处理压力的增加，原花青素的平均聚合度之间虽不存在显著性差异，220 MPa下平均聚合度相对较小；处理次数为4条件下平均聚合度最小。

固定处理次数为4，选择不同处理压力的样品进行抗氧化能力分析，包括铁还原力和DPPH自由基清除能力，抗氧化能力顺序为：220 MPa＞180 MPa＞140 MPa＞100 MPa＞260 MPa＞对照组＞VC；IC50的变化趋势完全与其相反，处理压力为220 MPa下的原花青素抗氧化能力最强。说明在一定范围内原花青素的平均聚合度越小其抗氧化能力越强。